效應(yīng)蛋白OspF參與志賀氏菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感的研究.pdf

1、細(xì)菌性痢疾是由志賀氏菌（shigella spp.）引起的全球性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全球約有1億人患有由志賀氏菌引起的疾病，死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)。其中約95％以上的病例都發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，在我國(guó)每年也有約2千萬(wàn)人感染細(xì)菌性痢疾。而且在臨床上，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多多重耐藥的志賀菌株。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和擴(kuò)散，給細(xì)菌性痢疾的有效治療帶來(lái)了困難。
　　臨床上治療細(xì)菌性痢疾常用的抗生素有β內(nèi)酰胺類(lèi)的氨芐西林、磺胺甲基異惡唑或氟喹

2、諾酮類(lèi)藥物環(huán)丙沙星和相對(duì)補(bǔ)液等。氟喹諾酮類(lèi)藥物是目前治療細(xì)菌性痢疾的首要選擇。但是它們作用于志賀氏菌的具體機(jī)制尚未研究清晰。
　　藥物與靶標(biāo)相互作用的經(jīng)典途徑主要有3種，第一種是抑制DNA的復(fù)制和修復(fù)，第二種是蛋白質(zhì)合成的抑制，第三種是抑制細(xì)胞壁的合成。研究人員最近發(fā)現(xiàn)了一種新的機(jī)制，抗生素可以通過(guò)增加活性氧（ROS）的濃度，從而殺死細(xì)菌。ROS的產(chǎn)生與三羧酸循環(huán)，NADH的瞬態(tài)損耗，不穩(wěn)定的鐵-硫簇，以及芬頓反應(yīng)的產(chǎn)生相關(guān)。志賀

3、氏菌對(duì)抗生素的耐受主要通過(guò)以下兩種機(jī)制，一種機(jī)制是抗生素靶基因的突變，另一種機(jī)制與外排泵系統(tǒng)的激活相關(guān)。志賀氏菌在感染宿主細(xì)胞時(shí)，其三型分泌系統(tǒng)會(huì)被激活，將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　氟喹諾酮類(lèi)藥物能以細(xì)菌內(nèi)的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV為靶標(biāo)，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制從而達(dá)到殺菌的效果。氟喹諾酮類(lèi)藥物還可以通過(guò)使細(xì)菌染色體片段化，在細(xì)菌體內(nèi)形成藥-酶-DNA穩(wěn)定裂解復(fù)合物等方式來(lái)殺菌。目前也有許多關(guān)于志賀氏菌

4、對(duì)喹諾酮藥物耐受機(jī)制的研究。細(xì)菌主要是通過(guò)以下幾個(gè)方式來(lái)降低藥物的殺傷力。第一種機(jī)制是細(xì)菌將編碼DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因突變，這些突變?cè)诓桓淖兠富钚缘耐瑫r(shí)增加細(xì)菌對(duì)喹諾酮藥物的耐受。這是細(xì)菌對(duì)喹諾酮藥物耐受的主要機(jī)制。第二種機(jī)制是細(xì)菌內(nèi)出現(xiàn)了一些耐藥性質(zhì)粒，這些質(zhì)粒能夠編碼一些能夠降低藥物與DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV結(jié)合能力的蛋白，有些還可以編碼與細(xì)菌外排泵相關(guān)的蛋白，使細(xì)菌主動(dòng)將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到體外。這種耐藥機(jī)制是可以隨著遺傳物

5、質(zhì)的復(fù)制時(shí)遺傳給下一代的。第三種是細(xì)菌染色體調(diào)節(jié)的對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐受的機(jī)制。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌染色體上的一些基因可以調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白通道上的孔蛋白，從而增加菌對(duì)藥物的耐受性。
　　首先，我們測(cè)定了氟喹諾酮類(lèi)藥物氧氟沙星對(duì)Shigella flexneri2a301野生株，突變株△OspF，以及回補(bǔ)株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration。MIC)，發(fā)現(xiàn)突變株△OspF相比其余兩個(gè)菌株對(duì)氧氟

6、沙星藥物出現(xiàn)了明顯的耐受現(xiàn)象。隨后我們又檢測(cè)了莫西沙星，環(huán)丙沙星，諾氟沙星，萘啶酸這些氟喹諾酮藥物對(duì)這三株菌的MIC，發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的情況，因此我們想要探究志賀氏菌△OspF突變株對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐受是怎樣進(jìn)行調(diào)控的。
　　在初步發(fā)現(xiàn)突變株△OspF對(duì)氟喹諾酮藥物耐受這一現(xiàn)象后，我們隨后采用不同濃度梯度的氟喹諾酮類(lèi)藥物處理這三株菌株，記錄菌株在藥物處理一定時(shí)間后的菌落形成單位（colony-forming unit,CFU)，并計(jì)算

7、存活率制作殺菌曲線，驗(yàn)證突變株△OspF對(duì)氟喹諾酮藥物的耐受表型。最后以過(guò)氧化氧(hydrogen peroxide,H202)處理以及厭氧環(huán)境培養(yǎng)菌株，來(lái)研究過(guò)氧化氫對(duì)志賀氏菌野生株和突變株的脅迫反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：志賀氏菌突變株△OspF在經(jīng)過(guò)莫西沙星，環(huán)丙沙星，諾氟沙星，環(huán)丙沙星，氧氟沙星，萘啶酸處理后，表現(xiàn)出對(duì)這些藥物的耐受表型。我們通過(guò) Western-blot以及 PCR，證明了突變株以及回補(bǔ)株的成功構(gòu)建。并且W

8、estern-blot驗(yàn)證了 OspF蛋白重組表達(dá)成功的回補(bǔ)株與野生型菌株一樣對(duì)這些藥物表現(xiàn)出了敏感表型。在雙氧水耐受水平上，突變株△OspF在較高濃度的雙氧水處理下比野生型菌株表現(xiàn)出了一定程度的耐受現(xiàn)象。并且在加了一定濃度的硫脲和2,2聯(lián)吡啶試劑后，能消除掉一定濃度的環(huán)丙沙星對(duì)野生型和突變株△OspF引起的殺菌作用。我們?cè)趨捬鯒l件下，測(cè)定環(huán)丙沙星以及莫西沙星對(duì)野生型以及突變株的殺菌作用時(shí)，存活率比有氧條件下的存活要高。說(shuō)明，活性氧的聚