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文檔簡介
1、細菌性痢疾是由志賀氏菌(shigella spp.)引起的全球性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,全球約有1億人患有由志賀氏菌引起的疾病,死亡人數(shù)超過100萬。其中約95%以上的病例都發(fā)生在發(fā)展中國家,在我國每年也有約2千萬人感染細菌性痢疾。而且在臨床上,科學家們發(fā)現(xiàn)了許多多重耐藥的志賀菌株。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和擴散,給細菌性痢疾的有效治療帶來了困難。
臨床上治療細菌性痢疾常用的抗生素有β內(nèi)酰胺類的氨芐西林、磺胺甲基異惡唑或氟喹
2、諾酮類藥物環(huán)丙沙星和相對補液等。氟喹諾酮類藥物是目前治療細菌性痢疾的首要選擇。但是它們作用于志賀氏菌的具體機制尚未研究清晰。
藥物與靶標相互作用的經(jīng)典途徑主要有3種,第一種是抑制DNA的復制和修復,第二種是蛋白質(zhì)合成的抑制,第三種是抑制細胞壁的合成。研究人員最近發(fā)現(xiàn)了一種新的機制,抗生素可以通過增加活性氧(ROS)的濃度,從而殺死細菌。ROS的產(chǎn)生與三羧酸循環(huán),NADH的瞬態(tài)損耗,不穩(wěn)定的鐵-硫簇,以及芬頓反應(yīng)的產(chǎn)生相關(guān)。志賀
3、氏菌對抗生素的耐受主要通過以下兩種機制,一種機制是抗生素靶基因的突變,另一種機制與外排泵系統(tǒng)的激活相關(guān)。志賀氏菌在感染宿主細胞時,其三型分泌系統(tǒng)會被激活,將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細胞內(nèi),引起細胞的炎癥反應(yīng)。
氟喹諾酮類藥物能以細菌內(nèi)的DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV為靶標,干擾細菌DNA的復制從而達到殺菌的效果。氟喹諾酮類藥物還可以通過使細菌染色體片段化,在細菌體內(nèi)形成藥-酶-DNA穩(wěn)定裂解復合物等方式來殺菌。目前也有許多關(guān)于志賀氏菌
4、對喹諾酮藥物耐受機制的研究。細菌主要是通過以下幾個方式來降低藥物的殺傷力。第一種機制是細菌將編碼DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV的基因突變,這些突變在不改變酶活性的同時增加細菌對喹諾酮藥物的耐受。這是細菌對喹諾酮藥物耐受的主要機制。第二種機制是細菌內(nèi)出現(xiàn)了一些耐藥性質(zhì)粒,這些質(zhì)粒能夠編碼一些能夠降低藥物與DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV結(jié)合能力的蛋白,有些還可以編碼與細菌外排泵相關(guān)的蛋白,使細菌主動將藥物轉(zhuǎn)運到體外。這種耐藥機制是可以隨著遺傳物
5、質(zhì)的復制時遺傳給下一代的。第三種是細菌染色體調(diào)節(jié)的對喹諾酮類藥物耐受的機制。近年來發(fā)現(xiàn)的細菌染色體上的一些基因可以調(diào)節(jié)細菌細胞膜蛋白通道上的孔蛋白,從而增加菌對藥物的耐受性。
首先,我們測定了氟喹諾酮類藥物氧氟沙星對Shigella flexneri2a301野生株,突變株△OspF,以及回補株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration。MIC),發(fā)現(xiàn)突變株△OspF相比其余兩個菌株對氧氟
6、沙星藥物出現(xiàn)了明顯的耐受現(xiàn)象。隨后我們又檢測了莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,萘啶酸這些氟喹諾酮藥物對這三株菌的MIC,發(fā)現(xiàn)了類似的情況,因此我們想要探究志賀氏菌△OspF突變株對氟喹諾酮類藥物的耐受是怎樣進行調(diào)控的。
在初步發(fā)現(xiàn)突變株△OspF對氟喹諾酮藥物耐受這一現(xiàn)象后,我們隨后采用不同濃度梯度的氟喹諾酮類藥物處理這三株菌株,記錄菌株在藥物處理一定時間后的菌落形成單位(colony-forming unit,CFU),并計算
7、存活率制作殺菌曲線,驗證突變株△OspF對氟喹諾酮藥物的耐受表型。最后以過氧化氧(hydrogen peroxide,H202)處理以及厭氧環(huán)境培養(yǎng)菌株,來研究過氧化氫對志賀氏菌野生株和突變株的脅迫反應(yīng)。
實驗結(jié)果表明:志賀氏菌突變株△OspF在經(jīng)過莫西沙星,環(huán)丙沙星,諾氟沙星,環(huán)丙沙星,氧氟沙星,萘啶酸處理后,表現(xiàn)出對這些藥物的耐受表型。我們通過 Western-blot以及 PCR,證明了突變株以及回補株的成功構(gòu)建。并且W
8、estern-blot驗證了 OspF蛋白重組表達成功的回補株與野生型菌株一樣對這些藥物表現(xiàn)出了敏感表型。在雙氧水耐受水平上,突變株△OspF在較高濃度的雙氧水處理下比野生型菌株表現(xiàn)出了一定程度的耐受現(xiàn)象。并且在加了一定濃度的硫脲和2,2聯(lián)吡啶試劑后,能消除掉一定濃度的環(huán)丙沙星對野生型和突變株△OspF引起的殺菌作用。我們在厭氧條件下,測定環(huán)丙沙星以及莫西沙星對野生型以及突變株的殺菌作用時,存活率比有氧條件下的存活要高。說明,活性氧的聚
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