轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒對(duì)碳青霉烯酶基因blaKPC-2在腸桿菌科細(xì)菌中水平播散的作用研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌是重要的醫(yī)院感染病原菌，因不規(guī)范的抗菌藥物使用，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥狀況不斷惡化，致使它們對(duì)大多數(shù)臨床常用的藥物的耐藥率＞50％。碳青霉烯類抗生素是僅剩的幾種對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌還保持高敏感性的藥物，近來出現(xiàn)了越來越多的對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，嚴(yán)重威脅著抗感染治療，引起了世界各國抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關(guān)注。KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapen

2、emase，KPC）的產(chǎn)生是目前引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因?，F(xiàn)有文獻(xiàn)顯示攜帶blaKPC-2的轉(zhuǎn)座子廣泛存在于不同大小、不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒中，其中大多數(shù)質(zhì)?？赏ㄟ^接合試驗(yàn)成功轉(zhuǎn)移至受體菌，攜帶blaKPC-2的宿主細(xì)菌也多種多樣。中國KPC酶（blaKPC-2編碼）的流行涉及轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和宿主三個(gè)環(huán)節(jié)。我們認(rèn)為blaKPC-2的流行可能并非簡單克隆播散，可能是由高活動(dòng)能力的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)，由寬宿主、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的質(zhì)粒，

3、通過接合播散至廣泛流行的不同種類的腸桿菌細(xì)菌。課題組收集自華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時(shí)間段內(nèi)所有腸桿菌科分離株為研究對(duì)象，首先對(duì)轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和細(xì)菌進(jìn)行恰當(dāng)?shù)姆中停缓笱芯棵恳涣餍协h(huán)節(jié)的特點(diǎn)及其對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移的作用，研究并正確評(píng)估每一個(gè)環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)，是掌握blaKPC-2在中國快速播散的機(jī)制，找到正確控制blaK PC-2致碳青霉烯類耐藥的基礎(chǔ)，為改進(jìn)或建立新的控制耐藥菌播散模式提供可靠的理論基礎(chǔ)，對(duì)醫(yī)院感染的監(jiān)控與治療具有較大

4、的意義。
　　第一部分 碳青霉烯酶KPC酶和膜孔蛋白OmpK35與OmpK36誰是導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要原因
　　目的:判定臨床分離的產(chǎn)2型碳?xì)涿赶┟傅姆窝卓死撞蛛x株中，β內(nèi)酰胺酶和OmpK35與OmpK36蛋白誰才是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。方法:連續(xù)收集57株非重復(fù)的耐碳?xì)涿赶╊惖姆窝卓死撞蛛x株，首先采用等電聚焦電泳初步分析細(xì)菌產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶的情況，再用PCR，基因測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)，

5、MLST法分析細(xì)菌的基因型別。然后選擇6株產(chǎn)生KPC酶的代表性分離株，采用qRT-PCR和蛋白電泳分析外膜蛋白的表達(dá)，PCR及PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)一步分析外膜蛋白的表達(dá)及功能，將外膜蛋白缺陷的菌株與外膜蛋白完整的菌株組成配對(duì)組，采用λ-Red重組法敲除blaKPC-2基因，比較兩組細(xì)菌及其在敲除blaKPC-2基因前后對(duì)碳青霉烯類的MICs，以研究KPC酶及外膜蛋白OmpK35與OmpK36在肺炎克雷伯菌臨床分離株對(duì)碳青霉烯類耐藥中的作用。

6、
　　結(jié)果:57株分離株共有4種MLST基因型，其中50株ST11型，5株ST423型，1株ST65型，有一株屬于新的MLST型別，ST977型。全部的6株代表性分離株均產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶KPC-2，TEM-1和CTX-M-14，分離株XJ-3和XJ-5還分別攜帶blaDHA-1和blaVM-1。在分離株XJ-1中，qRT-PCR和蛋白電泳均顯示OmpK35和OmpK36蛋白表達(dá)明顯下降，J-3和XJ-6分離株的ompK36基因突變導(dǎo)

7、致功能缺陷性，分離株XJ-2、XJ-4和J-5的OmpK35和Ompk36的表達(dá)和功能正常。藥敏結(jié)果顯示，外膜蛋白低表達(dá)或缺陷的菌株X J-1、XJ-3和J-6對(duì)碳青霉烯類的MICs高(＞32 mg/L)，而外膜蛋白表達(dá)和功能正常的菌株X J-2、XJ-4和XJ-6對(duì)碳青霉烯類的MICs相對(duì)較低(2-4 mg/L)，結(jié)果顯示外膜蛋白OmpK35和Ompk36在野生菌株對(duì)碳青霉烯類的耐用中有重要作用。敲除blaK PC-2基因后，分離株X

8、J-1和XJ-4對(duì)亞胺培南，美羅培南和厄他培南的MICs值都產(chǎn)生了8倍的下降，產(chǎn)生AmpC酶或其他種類碳青霉烯酶的分離株XJ-3和XJ-5，對(duì)碳青霉烯類的MICs則仍大幅降低。結(jié)果顯示敲除blaKPC-2基因的試驗(yàn)菌株對(duì)碳青霉烯類的耐藥似乎與外膜蛋白OmpK35和Ompk36是否正常無關(guān)。
　　結(jié)論:綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為臨床肺炎克雷伯菌株對(duì)碳青霉烯的耐藥中，是否產(chǎn)生碳青霉烯酶或其他β-內(nèi)酰胺酶是主導(dǎo)因素，外膜蛋白OmpK35

9、和OmpK36缺陷是輔助因素。
　　第二部分 轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒對(duì)碳青霉烯酶基因blaKPC-2在腸桿菌科細(xì)菌中水平播散的作用研究
　　目的:通過研究華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時(shí)間段內(nèi)108株產(chǎn)2型碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌分離株完整的blaKPC-2基因周圍DNA序列及重要質(zhì)粒的全序列，了解blaKPC-2基因在腸桿菌科細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)及菌細(xì)菌間的運(yùn)動(dòng)模式。
　　方法:收集華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時(shí)間段內(nèi)108株

10、攜帶KPC-2型碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌分離株。采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)受試菌株對(duì)21種抗菌藥物的敏感性，采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序檢測(cè)碳青霉烯酶基因，PCR mapping測(cè)定耐藥基因周圍環(huán)境和轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，利用MLST分型技術(shù)對(duì)菌株間的同源性進(jìn)行分析，通過接合實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒提取、Southem雜交等方法確定耐藥基因的定位的質(zhì)粒，鳥槍法測(cè)序測(cè)定攜帶耐藥基因的質(zhì)粒序列，并通過生物信息學(xué)方法分析基因結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:所有菌株均攜帶blaKPC-2

11、基因， blaKPC-2基因位于結(jié)構(gòu)不同的Tn1721-Tn3樣轉(zhuǎn)座子上，包括完整的Tn1721、Tn1721-Tn3樣轉(zhuǎn)座子及Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子，本批研究菌株中，出現(xiàn)最多的Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子(72/108)。攜帶blaKPC-2基因的轉(zhuǎn)座子可在不同類型的質(zhì)粒間移動(dòng)，接合性質(zhì)粒則是運(yùn)載blaKPC-2基因在不同MLST型別的腸桿菌科細(xì)菌及不同種類細(xì)菌間播散的工具。質(zhì)粒分型最初分離到的攜帶blaK PC-2的質(zhì)

12、粒以及隨后兩年散發(fā)發(fā)現(xiàn)的blaKPC-2陽性質(zhì)粒均為P31型，而導(dǎo)致blaKPC-2爆發(fā)的質(zhì)粒為F12型。
　　結(jié)論:攜帶blaKPC-2基因耐藥菌株已經(jīng)在國內(nèi)醫(yī)院廣泛流行，該基因最常位于Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子上，可通過不同型別的可接合質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，很好地揭示了國內(nèi)blaKPC-2基因的水平播散傳播途徑。
　　第三部分 轉(zhuǎn)座子Tn1721同時(shí)含有質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因fosA3和碳?xì)涿赶┟富騜laKPC-2

13、>　　為理解腸桿菌科分離株對(duì)碳?xì)涿赶┟改退幒土酌顾啬退幍倪z傳學(xué)背景和播散機(jī)制，研究了一株臨床大腸桿菌分離株HS102707，一株臨床產(chǎn)氣腸桿菌分離株HS112625，兩株分離株均對(duì)磷霉素耐藥，亞胺培南中敏，blaKPC-2和fosA3基因均陽性，此外，一株碳?xì)涿赶┠退幍酌顾孛舾械呐R床肺炎克雷伯桿菌分離株HS092839也被列入研究。通過接合試驗(yàn)，一個(gè)70kb的質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)移到受體菌大腸桿菌J53中。PCR和Southern blot試

14、驗(yàn)證實(shí)了blaKPC-2基因存在于此質(zhì)粒上。pHS102707全序列測(cè)序顯示質(zhì)粒含有一個(gè)復(fù)制基因trfA，parA和parB等幾個(gè)質(zhì)粒穩(wěn)定性基因，一套毒素抗毒素系統(tǒng)蛋白基因higA和higB，抗限制內(nèi)切酶基因klcA和klcB，兩套Ⅳ型分泌系統(tǒng)。在復(fù)制蛋白基因trfA的3'末端的質(zhì)粒穩(wěn)定模塊中插入了一個(gè)攜帶blaKPC-2基因的Tn1721-Tn3樣復(fù)合轉(zhuǎn)座子。在pHS102707和pHS112625中，一個(gè)含有fosA3基因的復(fù)合轉(zhuǎn)座