轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒對碳青霉烯酶基因blaKPC-2在腸桿菌科細(xì)菌中水平播散的作用研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌是重要的醫(yī)院感染病原菌，因不規(guī)范的抗菌藥物使用，腸桿菌科細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥狀況不斷惡化，致使它們對大多數(shù)臨床常用的藥物的耐藥率＞50％。碳青霉烯類抗生素是僅剩的幾種對大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌還保持高敏感性的藥物，近來出現(xiàn)了越來越多的對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，嚴(yán)重威脅著抗感染治療，引起了世界各國抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關(guān)注。KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapen

2、emase，KPC）的產(chǎn)生是目前引起腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因?，F(xiàn)有文獻(xiàn)顯示攜帶blaKPC-2的轉(zhuǎn)座子廣泛存在于不同大小、不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒中，其中大多數(shù)質(zhì)?？赏ㄟ^接合試驗(yàn)成功轉(zhuǎn)移至受體菌，攜帶blaKPC-2的宿主細(xì)菌也多種多樣。中國KPC酶（blaKPC-2編碼）的流行涉及轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和宿主三個環(huán)節(jié)。我們認(rèn)為blaKPC-2的流行可能并非簡單克隆播散，可能是由高活動能力的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)，由寬宿主、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的質(zhì)粒，

3、通過接合播散至廣泛流行的不同種類的腸桿菌細(xì)菌。課題組收集自華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內(nèi)所有腸桿菌科分離株為研究對象，首先對轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和細(xì)菌進(jìn)行恰當(dāng)?shù)姆中?，然后研究每一流行環(huán)節(jié)的特點(diǎn)及其對基因水平轉(zhuǎn)移的作用，研究并正確評估每一個環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)，是掌握blaKPC-2在中國快速播散的機(jī)制，找到正確控制blaK PC-2致碳青霉烯類耐藥的基礎(chǔ)，為改進(jìn)或建立新的控制耐藥菌播散模式提供可靠的理論基礎(chǔ)，對醫(yī)院感染的監(jiān)控與治療具有較大

4、的意義。
　　第一部分 碳青霉烯酶KPC酶和膜孔蛋白OmpK35與OmpK36誰是導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因
　　目的:判定臨床分離的產(chǎn)2型碳?xì)涿赶┟傅姆窝卓死撞蛛x株中，β內(nèi)酰胺酶和OmpK35與OmpK36蛋白誰才是導(dǎo)致細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。方法:連續(xù)收集57株非重復(fù)的耐碳?xì)涿赶╊惖姆窝卓死撞蛛x株，首先采用等電聚焦電泳初步分析細(xì)菌產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶的情況，再用PCR，基因測序進(jìn)一步確認(rèn)，

5、MLST法分析細(xì)菌的基因型別。然后選擇6株產(chǎn)生KPC酶的代表性分離株，采用qRT-PCR和蛋白電泳分析外膜蛋白的表達(dá)，PCR及PCR產(chǎn)物測序進(jìn)一步分析外膜蛋白的表達(dá)及功能，將外膜蛋白缺陷的菌株與外膜蛋白完整的菌株組成配對組，采用λ-Red重組法敲除blaKPC-2基因，比較兩組細(xì)菌及其在敲除blaKPC-2基因前后對碳青霉烯類的MICs，以研究KPC酶及外膜蛋白OmpK35與OmpK36在肺炎克雷伯菌臨床分離株對碳青霉烯類耐藥中的作用。

6、
　　結(jié)果:57株分離株共有4種MLST基因型，其中50株ST11型，5株ST423型，1株ST65型，有一株屬于新的MLST型別，ST977型。全部的6株代表性分離株均產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶KPC-2，TEM-1和CTX-M-14，分離株XJ-3和XJ-5還分別攜帶blaDHA-1和blaVM-1。在分離株XJ-1中，qRT-PCR和蛋白電泳均顯示OmpK35和OmpK36蛋白表達(dá)明顯下降，J-3和XJ-6分離株的ompK36基因突變導(dǎo)

7、致功能缺陷性，分離株XJ-2、XJ-4和J-5的OmpK35和Ompk36的表達(dá)和功能正常。藥敏結(jié)果顯示，外膜蛋白低表達(dá)或缺陷的菌株X J-1、XJ-3和J-6對碳青霉烯類的MICs高(＞32 mg/L)，而外膜蛋白表達(dá)和功能正常的菌株X J-2、XJ-4和XJ-6對碳青霉烯類的MICs相對較低(2-4 mg/L)，結(jié)果顯示外膜蛋白OmpK35和Ompk36在野生菌株對碳青霉烯類的耐用中有重要作用。敲除blaK PC-2基因后，分離株X

8、J-1和XJ-4對亞胺培南，美羅培南和厄他培南的MICs值都產(chǎn)生了8倍的下降，產(chǎn)生AmpC酶或其他種類碳青霉烯酶的分離株XJ-3和XJ-5，對碳青霉烯類的MICs則仍大幅降低。結(jié)果顯示敲除blaKPC-2基因的試驗(yàn)菌株對碳青霉烯類的耐藥似乎與外膜蛋白OmpK35和Ompk36是否正常無關(guān)。
　　結(jié)論:綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為臨床肺炎克雷伯菌株對碳青霉烯的耐藥中，是否產(chǎn)生碳青霉烯酶或其他β-內(nèi)酰胺酶是主導(dǎo)因素，外膜蛋白OmpK35

9、和OmpK36缺陷是輔助因素。
　　第二部分 轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒對碳青霉烯酶基因blaKPC-2在腸桿菌科細(xì)菌中水平播散的作用研究
　　目的:通過研究華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內(nèi)108株產(chǎn)2型碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌分離株完整的blaKPC-2基因周圍DNA序列及重要質(zhì)粒的全序列，了解blaKPC-2基因在腸桿菌科細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)及菌細(xì)菌間的運(yùn)動模式。
　　方法:收集華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內(nèi)108株

10、攜帶KPC-2型碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌分離株。采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測受試菌株對21種抗菌藥物的敏感性，采用PCR擴(kuò)增和測序檢測碳青霉烯酶基因，PCR mapping測定耐藥基因周圍環(huán)境和轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，利用MLST分型技術(shù)對菌株間的同源性進(jìn)行分析，通過接合實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒提取、Southem雜交等方法確定耐藥基因的定位的質(zhì)粒，鳥槍法測序測定攜帶耐藥基因的質(zhì)粒序列，并通過生物信息學(xué)方法分析基因結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:所有菌株均攜帶blaKPC-2

11、基因， blaKPC-2基因位于結(jié)構(gòu)不同的Tn1721-Tn3樣轉(zhuǎn)座子上，包括完整的Tn1721、Tn1721-Tn3樣轉(zhuǎn)座子及Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子，本批研究菌株中，出現(xiàn)最多的Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子(72/108)。攜帶blaKPC-2基因的轉(zhuǎn)座子可在不同類型的質(zhì)粒間移動，接合性質(zhì)粒則是運(yùn)載blaKPC-2基因在不同MLST型別的腸桿菌科細(xì)菌及不同種類細(xì)菌間播散的工具。質(zhì)粒分型最初分離到的攜帶blaK PC-2的質(zhì)

12、粒以及隨后兩年散發(fā)發(fā)現(xiàn)的blaKPC-2陽性質(zhì)粒均為P31型，而導(dǎo)致blaKPC-2爆發(fā)的質(zhì)粒為F12型。
　　結(jié)論:攜帶blaKPC-2基因耐藥菌株已經(jīng)在國內(nèi)醫(yī)院廣泛流行，該基因最常位于Tn1721-IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子上，可通過不同型別的可接合質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，很好地揭示了國內(nèi)blaKPC-2基因的水平播散傳播途徑。
　　第三部分 轉(zhuǎn)座子Tn1721同時含有質(zhì)粒介導(dǎo)磷霉素耐藥基因fosA3和碳?xì)涿赶┟富騜laKPC-2

13、>　　為理解腸桿菌科分離株對碳?xì)涿赶┟改退幒土酌顾啬退幍倪z傳學(xué)背景和播散機(jī)制，研究了一株臨床大腸桿菌分離株HS102707，一株臨床產(chǎn)氣腸桿菌分離株HS112625，兩株分離株均對磷霉素耐藥，亞胺培南中敏，blaKPC-2和fosA3基因均陽性，此外，一株碳?xì)涿赶┠退幍酌顾孛舾械呐R床肺炎克雷伯桿菌分離株HS092839也被列入研究。通過接合試驗(yàn)，一個70kb的質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)移到受體菌大腸桿菌J53中。PCR和Southern blot試

14、驗(yàn)證實(shí)了blaKPC-2基因存在于此質(zhì)粒上。pHS102707全序列測序顯示質(zhì)粒含有一個復(fù)制基因trfA，parA和parB等幾個質(zhì)粒穩(wěn)定性基因，一套毒素抗毒素系統(tǒng)蛋白基因higA和higB，抗限制內(nèi)切酶基因klcA和klcB，兩套Ⅳ型分泌系統(tǒng)。在復(fù)制蛋白基因trfA的3'末端的質(zhì)粒穩(wěn)定模塊中插入了一個攜帶blaKPC-2基因的Tn1721-Tn3樣復(fù)合轉(zhuǎn)座子。在pHS102707和pHS112625中，一個含有fosA3基因的復(fù)合轉(zhuǎn)座