產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)及耐藥特點(diǎn)研究.pdf

1、研究背景：
　　腸桿菌科細(xì)菌是社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染的重要條件致病菌，主要引起呼吸系統(tǒng)感染和泌尿系統(tǒng)感染，在免疫力低下的患者中可引起嚴(yán)重甚至致死性的感染。而碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床上作為治療腸桿菌科細(xì)菌感染最強(qiáng)而有力的一類抗菌藥物，包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等，其對(duì)極大多數(shù)由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶都有較高的穩(wěn)定性，且與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)親和力強(qiáng)，能有效地滲透細(xì)菌外膜，并存在抗生素后效應(yīng)，因其抗菌譜

2、廣、抗菌活性強(qiáng)、殺菌作用快，臨床上碳青霉烯類抗菌藥物廣泛用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC酶）細(xì)菌引起的感染。
　　但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，國(guó)內(nèi)外開始報(bào)道對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物不敏感甚至耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，這極大地限制了碳青霉烯類抗菌藥物的使用，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的重要原因是菌株獲得了碳青霉烯酶基因。其中由質(zhì)粒攜帶的碳青霉烯酶基因由于其耐藥基因環(huán)境存在介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的基因元件，使得其易于在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)

3、移，造成了碳青霉烯酶耐藥性的廣泛傳播，成為近年臨床微生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。
　　本研究通過(guò)采用法國(guó)梅里埃 Vitek2全自動(dòng)微生物鑒定儀與藥物敏感儀對(duì)收集的耐藥菌株進(jìn)行鑒定及藥敏分析，對(duì)本院可疑的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株進(jìn)行多重 PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因，并對(duì)耐藥基因陽(yáng)性的菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，以了解耐藥基因的傳播方式；通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中一株接合轉(zhuǎn)移成功的多重耐藥菌株進(jìn)行質(zhì)粒全序列的測(cè)定，獲得的全序列通過(guò)生物信息學(xué)分析，展開

4、對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥基因環(huán)境及耐藥機(jī)制的研究。
　　研究目的：
　　了解本院臨床分離的腸桿菌科菌株的耐藥特點(diǎn)及產(chǎn)碳青霉烯酶情況，探討產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因的傳播方式及可能的耐藥機(jī)制，為臨床控制耐藥基因的傳播提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.菌株收集和藥敏實(shí)驗(yàn)收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室分離的來(lái)自不同科室的不同標(biāo)本類型的耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科菌株共18株。全部菌株的鑒定及藥

5、敏實(shí)驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃Vitek2全自動(dòng)微生物鑒定儀與藥物敏感儀完成，藥敏結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S222012版進(jìn)行判讀。
　　2.菌株DNA模板的制備及多重PCR實(shí)驗(yàn)菌株DNA模板的制備采用煮沸法，利用多重PCR方法對(duì)所有的菌株進(jìn)行11種碳青霉烯酶基因blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaVIM、blaOXA、blaGIM、blaBIC、blaSIM、blaNDM、blaDIM、blaKPC

6、的檢測(cè)，陽(yáng)性 PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，所得序列于網(wǎng)上BLAST比對(duì)，最終確定其基因亞型。
　　3.耐藥基因傳播方式研究對(duì)所有攜帶碳青霉烯酶基因的菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)并采用法國(guó)梅里埃 Vitek2全自動(dòng)微生物鑒定儀與藥物敏感儀對(duì)接合子進(jìn)行鑒定和檢測(cè)藥敏，藥敏結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S222012版進(jìn)行判讀。對(duì)攜帶碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌株進(jìn)行 MLST分型，以和國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的情況進(jìn)行比較。<

7、br>　　4.將多重耐藥菌株肺炎克雷伯菌（KP）DQ49與受體菌EC600進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，PCR驗(yàn)證接合成功后，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取接合子基因組DNA，并利用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定，得到的數(shù)據(jù)用Edena軟件拼接，并利用RAST網(wǎng)上注釋工具對(duì)得到的質(zhì)粒全序列進(jìn)行注釋，使用網(wǎng)上序列比對(duì)工具BLAST進(jìn)行耐藥基因環(huán)境分析，使用PlasmidFinder網(wǎng)上工具進(jìn)行質(zhì)粒不相容性分析，使用ResF

8、inder網(wǎng)上工具進(jìn)行耐藥基因分析，使用MLST網(wǎng)上工具進(jìn)行ST分型分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.藥敏結(jié)果18株耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細(xì)菌中包括肺炎克雷伯菌12株、大腸埃希菌2株、陰溝腸桿菌2株、植生拉烏爾菌1株、弗氏檸檬酸桿菌1株；科室分布為重癥監(jiān)護(hù)病房13株、泌尿外科2株、心血管內(nèi)科1株、肝膽科1株、胃腸外科1株；標(biāo)本類型為痰7株、中段尿2株、膽汁2株、腹腔引流液2株、插管導(dǎo)管1株、導(dǎo)管頭1株、血液1株、分泌物

9、1株、其他1株。經(jīng)檢測(cè)，18株菌對(duì)碳青霉烯類、青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、單環(huán)內(nèi)酰胺類抗菌藥物表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，表現(xiàn)為多重耐藥；但對(duì)氨基糖苷類的阿米卡星、慶大霉素，磺胺類的呋喃妥因、復(fù)方新諾明，甘氨酰環(huán)素類的替加環(huán)素，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星的耐藥性卻有不同。
　　2.多重PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因結(jié)果用多重PCR對(duì)18株碳青霉烯類耐藥菌進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些菌株均攜帶碳青霉烯酶基因，全部送測(cè)序，其中8株為blaN

10、DM-1型，8株為blaKPC-2型，1株為blaVIM-1型，1株為blaIMP-26型。
　　3.耐藥基因水平傳播方式及肺炎克雷伯菌MLST結(jié)果在接合實(shí)驗(yàn)中，有10株菌成功地將質(zhì)粒傳遞給受體菌EC600，其中包括肺炎克雷伯菌7株，大腸埃希菌2株，陰溝腸桿菌1株；8株通過(guò)電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌DH5α，其中包括肺炎克雷伯菌5株，陰溝腸桿菌1株，植生拉烏爾菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株。選取12株肺炎克雷伯菌進(jìn)行MLST分析

11、，其中ST11型有10株，占大部分；ST20型1株；1株為ST2460，為首次報(bào)道。
　　4.通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)得到攜帶耐藥基因blaIMP-26的質(zhì)粒pIMP26_DQ49，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行全序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，pIMP26_DQ49屬于質(zhì)粒不相容群（Inc）中的IncN群，是大小為55179bp的環(huán)狀質(zhì)粒，攜帶三個(gè)耐藥基因，G+C含量為50.4％，預(yù)測(cè)編碼52個(gè)功能基因。BLAST發(fā)現(xiàn)pIMP26_DQ49與已報(bào)道的pIMP_HZ1序

12、列相似度高達(dá)99%，且攜帶的可移動(dòng)基因元件也高度相似，其耐藥基因環(huán)境包含可導(dǎo)致轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的IS903D、IS2、Tn2、Tn3、tnp、tnpA，以及能捕獲和整合外源性基因的1類整合子基因intI1。
　　結(jié)論：
　　耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科菌株均攜帶碳青霉烯酶基因，這些基因均可以通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)或電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在同科細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移；肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒 pIMP26_DQ49攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM-1、氟喹諾