菜菔硫烷抑制人腺樣囊性癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），是一種口腔頜面外科最常見(jiàn)的惡性涎腺上皮來(lái)源性腫瘤。它有嗜神經(jīng)血管性生長(zhǎng)特點(diǎn)，有著較強(qiáng)韻局部侵襲性，因而容易發(fā)生血行性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性;同時(shí)該病惡性程度高，對(duì)于放射治療的敏感性卻較低。正因?yàn)槿绱耍撃[瘤手術(shù)切除后具有較高的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率居口腔頜面部首位。然而，涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病及其轉(zhuǎn)移機(jī)制目前仍不十分清楚。因而

2、探索新的治療方法，來(lái)提高對(duì)腺樣囊性癌的治療效果，減少局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率，改善患者的生存質(zhì)量就更顯得尤為重要。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是一種天然存在于十字花科蔬菜中屬于異硫氰酸鹽(isothiocyanates，ITCS)類(lèi)的物質(zhì)。該類(lèi)物質(zhì)具有強(qiáng)抗癌作用，近些年來(lái)相繼有研究報(bào)道萊菔硫烷具有抗腫瘤作用，我們前期的體外實(shí)驗(yàn)表明，萊菔硫烷能夠抑制腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M的增殖，觸發(fā)由Caspase介導(dǎo)的凋亡，并且Bc

3、l-2家族成員在凋亡中起重要作用。但是在體內(nèi)環(huán)境中，萊菔硫烷能否抑制腺樣囊性癌的生長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)中，我們采用了人肺高轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M進(jìn)行裸鼠的皮下接種，建立了裸鼠移植瘤模型，通過(guò)口服給予適宜劑量的萊菔硫烷后，觀察萊菔硫烷對(duì)人涎腺腺樣囊性癌體內(nèi)移植瘤模型是否具有抑制增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，探討其可能的分子作用機(jī)制，旨在為腺樣囊性癌的多模式治療中拓展新的植物化學(xué)藥物治療途徑提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料。
　　方

4、法:
　　1.材料
　　1.1人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-M:由中國(guó)上海交通大學(xué)口腔頜面外科實(shí)驗(yàn)室提供，該細(xì)胞系建立于1995年。
　　1.2 萊菔硫烷(SFN):美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心頭頸外科提供，購(gòu)自L(fǎng)KT實(shí)驗(yàn)室，純度≥99％。
　　1.3 裸鼠:北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，10只雄性裸鼠，4～6周齡，體重16～20克。
　　1.4 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒:購(gòu)自美國(guó)ROCHE公司
　　1

5、.5 DAB檢測(cè)試劑盒:購(gòu)于河北博海生物工程有限公司
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1 藥液配制:萊菔硫烷用磷酸鹽緩釋液PBS稀釋成100mmol/L濃度的儲(chǔ)存液，冰凍于-20℃冰箱中。
　　2.2 細(xì)胞培養(yǎng):將凍存的ACC-M細(xì)胞系予以復(fù)蘇，培養(yǎng)液均采用RPMI1640加入10％的胎牛血清和青霉素(100U/mL)、鏈霉素（100μg/mL）按比例配制，將復(fù)蘇后的細(xì)胞置于37℃、5％CO2恒溫恒濕箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液，約7

6、2～96h后可以傳代。
　　2.3 細(xì)胞接種及動(dòng)物模型的建立:細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml的細(xì)胞懸液。將ACC-M細(xì)胞懸液接種于10只裸小鼠背部皮下，每只選擇左前背部和右后背部2個(gè)注射點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.2ml。
　　2.4 分組給藥:荷瘤鼠隨機(jī)分為A、B兩組，每組5只。A組為實(shí)驗(yàn)組，應(yīng)用SFN，B組為對(duì)照組，應(yīng)用PBS。注射前常規(guī)以碘酊消毒注射區(qū)皮膚，兩組均采用經(jīng)口腔給藥，腫瘤接種當(dāng)天開(kāi)始給藥，3次

7、/周（周一，周三，周五），連續(xù)三周。A組每次給予60mmol/L的SFN0.1 ml，B組每次給予相同劑量的PBS。每次給藥時(shí)觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水及活動(dòng)并測(cè)量裸鼠體重和腫瘤體積。
　　2.5 腫瘤體積的測(cè)量和腫瘤生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算:每次給藥后用卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)及高(c)，同時(shí)計(jì)算腫瘤的體積，計(jì)算公式為:腫瘤體積V=π×a×b×c/6，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn);計(jì)算腫瘤的生長(zhǎng)抑制率，公式為:抑瘤率=對(duì)照組平均體積

8、-用藥組平均體積/對(duì)照組平均體積×100％。在結(jié)束給藥后的第二天（即第23天），通過(guò)頸椎脫臼的方法處死裸鼠，并用碘伏消毒，眼科鉗、手術(shù)刀快速剝離瘤體組織，除去瘤體表面的壞死組織等。測(cè)量各組移植瘤直徑，電子天平稱(chēng)瘤重。
　　2.6 用TUNEL法檢測(cè)裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡:將人腺樣囊性癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的組織標(biāo)本，用4％多聚甲醛液固定24個(gè)小時(shí)，然后用石蠟包埋瘤體組織作冠狀面切片，每個(gè)組織標(biāo)本切2張，標(biāo)本組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯的脫蠟和梯度乙

9、醇脫水后，依據(jù)TUNEL法，在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，將生物素化的dUTP標(biāo)記至DNA斷裂后形成3'-OH末端，并將過(guò)氧化物酶憑借親和素和生物素的特異性結(jié)合，連接至DNA斷點(diǎn)，最后加入底物，通過(guò)3，3-二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。
　　2.7 結(jié)果判定:光鏡下可觀察到細(xì)胞核棕黃色著色的凋亡細(xì)胞。MoticMed6.0圖像分析系隨機(jī)拍攝10個(gè)400倍（10個(gè)目鏡×40物鏡）視野，腫瘤細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色，對(duì)每張切

10、片進(jìn)行評(píng)價(jià)，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)分(IHS)。為了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析的方便，把陰性與弱陽(yáng)性均歸為陰性組，中等陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性均歸為陽(yáng)性組。
　　2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:腫瘤體積和重量的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。TUNEL法的免疫組織化學(xué)評(píng)分按實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法分析組間差異，P＜0.05定為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。
　　結(jié)果:SFN