Bcl-2家族成員在菜菔硫烷抑制人涎腺腺樣囊性癌移植瘤中的作用.pdf

1、目的:裸鼠是一種全身沒(méi)有毛發(fā)，缺乏胸腺的動(dòng)物。胸腺具有制造T細(xì)胞的功能。裸鼠缺乏T細(xì)胞的原因是由于其一基因的突變，這種突變基因被稱(chēng)為nu基因，屬于隱性遺傳基因，只有當(dāng)nu/nu結(jié)合時(shí)，才能出現(xiàn)表現(xiàn)型。T細(xì)胞具有免疫的功能，能夠輔助機(jī)體抑制以及殺傷進(jìn)入體內(nèi)的外源物質(zhì)。沒(méi)有胸腺，不能產(chǎn)生T細(xì)胞的裸鼠，其免疫力很低，當(dāng)外源物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，不能夠及時(shí)的被抑制或者消除。基于裸鼠的這些特征，其就成為了移植瘤模型的一種理想動(dòng)物。通常，裸鼠經(jīng)常被用來(lái)研

2、究惡性腫瘤的治療。根據(jù)裸鼠的這些特征，裸鼠移植瘤模型就成為本次實(shí)驗(yàn)研究Bcl-2家族成員在萊菔硫烷抑制人涎腺腺樣囊性癌移植瘤中的作用的理想模型。
　　涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種惡性程度較高的口腔頜面部腫瘤。其臨床特征為轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，浸潤(rùn)周?chē)窠?jīng)生長(zhǎng)等。細(xì)胞學(xué)特征主要是基底細(xì)胞樣腫瘤，由上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞組成并排列成類(lèi)管狀，類(lèi)篩網(wǎng)狀，和實(shí)性巢樣等不同的結(jié)構(gòu)。

3、r>　　根據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)，萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)能夠在體外抑制涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SFN誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌凋亡的過(guò)程是由Caspase介導(dǎo)的。另外，在體外萊菔硫烷誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl-2家族成員起到了不可忽視的作用:萊菔硫烷可以引起促凋亡蛋白因子Bax、Bak的表達(dá)增加，而使抗凋亡蛋白因子Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)下降。我們剛剛進(jìn)行的萊菔硫烷抑制人腺樣囊性癌裸鼠

4、移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，體內(nèi)環(huán)境中，萊菔硫烷可抑制腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的增殖生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)腺樣囊性癌ACC-M在裸鼠移植瘤中發(fā)生細(xì)胞凋亡。在這個(gè)過(guò)程中，Bcl-2蛋白家族是否也和體外實(shí)驗(yàn)一樣，起到重要作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的，是利用人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞構(gòu)建的裸鼠移植瘤模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法來(lái)驗(yàn)證Bcl-2家族蛋白的表達(dá)是否與體外實(shí)驗(yàn)中萊菔硫烷誘導(dǎo)人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞凋亡的情況一致。
　　方法:

5、r>　　1.細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇凍存的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞，在37度，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定濃度時(shí)，用0.25％的胰酶進(jìn)行消化傳代，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml的細(xì)胞懸液。
　　2.建立移植瘤模型:將預(yù)備好的細(xì)胞懸液注射于裸鼠的左前背部以及右后背部，并分組（給藥組、對(duì)照組）經(jīng)口腔給藥，給藥組給予萊菔硫烷（6 mmol SFN/0.1 ml PBS），對(duì)照組給予等量的PBS，每周給藥3次。觀察。

6、>　　3.解剖瘤體:三周后，采用斷頸的方法處死裸鼠，通過(guò)外科手術(shù)的方法剝離瘤體，去除瘤體表面的壞死組織，以及小血管組織等。剝離下來(lái)的腫瘤組織經(jīng)過(guò)石蠟的包埋，處理，制成蠟塊，備用。
　　4.免疫組織化學(xué)染色:將制成的蠟片，采用免疫組織化學(xué)染色的方法，在顯微鏡下觀察Bcl-2家族成員中Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Bak四種蛋白的表達(dá)情況，并記分。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用秩和檢驗(yàn)的方法對(duì)等級(jí)資料結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算分析，并得出