Ghrelin對高脂環(huán)境下大鼠成肌細胞甘油三酯沉積及葡萄糖攝取的影響及其分子機制.pdf

1、近年來，逐漸增多的肥胖和糖尿病帶來了很多并發(fā)癥，糖尿病和肥胖及其相關(guān)的胰島素抵抗、β細胞功能和免疫炎癥研究無疑成為現(xiàn)在研究的熱點。研究表明，血清游離脂肪酸(FFA)升高和甘油三脂在非脂肪組織（例如肝臟，肌肉和胰腺）的異位沉積與胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭相關(guān)。
　　肌肉是葡萄糖代謝的主要組織，大約75％胰島素刺激的葡萄糖吸收在肌肉進行。很多研究都顯示IR和肌肉細胞內(nèi)的脂肪沉積密切相關(guān)。Perseghin等發(fā)現(xiàn)，肌細胞內(nèi)異常的脂質(zhì)

2、代謝和甘油三酯沉積與葡萄糖高風(fēng)險個體的全身胰島素抵抗相關(guān)，其在2型糖尿病的發(fā)病機制中可能起主要作用。
　　最近發(fā)現(xiàn)了一種新的多肽——生長激素釋放肽(Ghrelin)，能刺激生長激素(GH)的分泌，人們相繼研究發(fā)現(xiàn)它可以調(diào)節(jié)能量代謝、胃腸功能、抑制腫瘤細胞增殖和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能，并影響其他激素的釋放，已經(jīng)受到了很多學(xué)者的關(guān)注，成為代謝領(lǐng)域的研究熱點之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin與胰島素抵抗及胰島素分泌調(diào)節(jié)有關(guān)，這提示我們Gh

3、relin與糖尿病的發(fā)病環(huán)節(jié)有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)在許多外周組織細胞，Ghrelin通過與不同亞型的GHS-R結(jié)合并激活一系列信號傳導(dǎo)環(huán)節(jié)如AMPK途徑和Akt信號途徑而調(diào)節(jié)細胞增殖分化、脂質(zhì)代謝、抗炎癥反應(yīng)等作用。骨骼肌是周圍胰島素抵抗的主要靶位。但是，Ghrelin與骨骼肌胰島素抵抗的機制仍有待探討。Barazzoni等在給大鼠靜脈注入Ghrelin后，發(fā)現(xiàn)Ghrelin可使比目魚肌Akt通路活化、GLUT4 mRNA轉(zhuǎn)錄增加，提示

4、Ghrelin促進骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運，從而提高胰島素敏感性。Heijboer等研究發(fā)現(xiàn)給小鼠靜脈注入Ghrelin可促進骨骼肌葡萄糖利用。以上研究均是動物體內(nèi)試驗，因此無法判斷是否通過其中樞作用所介導(dǎo)。最近有研究證實骨骼肌細胞膜表面存在Ghrelin的特異性結(jié)合位點，提示Ghrelin可能對骨骼肌細胞葡萄糖代謝發(fā)揮直接作用，但是目前國內(nèi)外還未見報道。
　　目的：
　　1、探討高脂環(huán)境對大鼠成肌細胞甘油三酯的含量及葡萄糖攝取的

5、影響；
　　2、探討Ghrelin對脂毒性作用下大鼠成肌細胞甘油三酯沉積及葡萄糖攝取的影響；
　　3、Ghrelin影響大鼠成肌細胞糖脂代謝的環(huán)節(jié)及發(fā)生機制。
　　方法：
　　三日齡wistar大鼠，提取大鼠成肌細胞，進行原代培養(yǎng)，并行免疫組化鑒定。
　　應(yīng)用不同濃度棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)大鼠成肌細胞脂肪變性，MTT法檢測細胞活力，油紅O染色方法顯示細胞內(nèi)甘油三酯沉積，GPO-POD酶法測定細胞內(nèi)甘油三酯含量，

6、同位素示蹤法檢測細胞3氚標記-2-脫氧-左旋-葡萄糖（2-dexoy-D-[3H]glucose）的攝取情況。以確定PA誘導(dǎo)大鼠成肌細胞脂肪變性的最佳濃度及時間。
　　應(yīng)用棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)大鼠成肌細胞脂肪變性，應(yīng)用油紅O染色方法及GPO-POD酶法確定Ghrelin對高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細胞甘油三酯沉積的影響，應(yīng)用同位素示蹤法檢測Ghrelin對高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細胞3氚標記-2-脫氧-左旋-葡萄糖（2-dexoy-D-[3H

7、]glucose）攝取的影響。
　　應(yīng)用RT-PCR及Western Blot方法，研究Ghrelin對高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細胞GLUT4、AMPK、ACC、UCP3 mRNA表達和蛋白水平的影響，從而研究Ghrelin對高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細胞糖脂代謝影響的分子機制。
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計:將所有數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5。全部計量資料以mean±SD表示，多組間計量資料比較采用F檢驗(One-Way ANOVA)，兩兩比較應(yīng)用q檢

8、驗(S-N-K法)。P＜0.05判定為具有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、成肌細胞克隆樣梭形生長，成肌細胞內(nèi)部可見多個核仁。免疫組化鑒定成肌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽性染色。
　　2、MTT比色法顯示隨著棕櫚酸(PA)處理濃度(0.1～0.5 mM)的增加，及暴露時間(6～24h)的增加，成肌細胞活力不斷降低，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性的效應(yīng)關(guān)系。與對照組比較，PA濃度為0.1mM組細胞活力均不受影響，PA濃度為0.3 mM

9、，反應(yīng)時間6h及12h時細胞活力不受影響，PA濃度為0.3mM、反應(yīng)時間24小時及PA濃度為0.5mM組細胞活力均顯著下降(P＜0.01)。因此，PA誘導(dǎo)大鼠成肌細胞脂肪變性模型的反應(yīng)條件應(yīng)在細胞活力不受影響的組中選擇。
　　3、油紅O染色方法顯示正常培養(yǎng)的細胞（未加PA）中未見甘油三酯沉積。加入PA培養(yǎng)6h細胞內(nèi)可見少量脂肪變性細胞，脂滴數(shù)量較少，12h、24h脂變細胞數(shù)量明顯增多，細胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴，部分脂滴融合。0.1m

10、M棕櫚酸PA組脂滴數(shù)量較少，隨PA濃度升高、脂滴沉積增加，但12和24小時無顯著差異。
　　4、GPO-POD酶法測定大鼠成肌細胞甘油三脂含量，與對照相比，0.1mM PA組及0.3mM PA6h組甘油三脂含量無明顯增加，甘油三酯含量隨PA濃度增加、作用時間延長而增加，12和24小時無顯著差異，即0.3mM PA12h、24h組和0.5mM PA組有明顯甘油三脂沉積(P＜0.01)。
　　5、同位素示蹤法檢測大鼠成肌細胞糖攝

11、取，隨PA濃度升高、作用時間延長，大鼠成肌細胞糖攝取減低，但12和24小時無顯著差異。0.1mM PA24h及0.3mMPA12h、24h及0.5mMPA12h、24h各組的大鼠成肌細胞糖攝取顯著減低(P＜0.01)。
　　6、加入0.3mmol/L PA培養(yǎng)12h（B組）可見脂變細胞，細胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴，部分脂滴融合。加Ghrelin干預(yù)組(C-E)脂滴數(shù)減少，隨Ghrelin濃度升高、脂滴沉積減少。
　　7、與正常對

12、照（A組）相比，高脂組及Ghrelin干預(yù)組各組成肌細胞中甘油三脂含量明顯增加(p＜0.01);與高脂組（B組）比較，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組（D、E組）成肌細胞中甘油三酯含量明顯減少(p＜0.05，p＜0.01);與10-11MGhrelin組（C組）比較，10-7MGhrelin干預(yù)組（E組）成肌細胞中甘油三酯含量明顯減少(p＜0.01)。
　　8、與正常對照（A組）相比，高脂組及10-11M Ghreli

13、n干預(yù)組（B、C組）成肌細胞糖攝取減低(p＜0.01，p＜0.05);與高脂組（B組）比較，Ghrelin干預(yù)各組（C-E組）成肌細胞糖攝取明顯增加(p＜0.05，p＜0.01);與10-11M Ghrelin組(C組)比較，10-7M Ghrelin干預(yù)組（E組）成肌細胞中糖攝取明顯增加(p＜0.05)。
　　9、與對照組相比，高脂組及干預(yù)組GLUT4、AMPK mRNA相對表達率、GLUT4蛋白相對水平均無明顯改變，
　

14、　10、與對照組相比，0.3mM PA組和10-9M、10-11M Ghrelin干預(yù)組的UCP3mRNA相對表達率明顯降低(p＜0.01)，10-7M Ghrelin干預(yù)組無顯著差異;與0.3mM PA組相比，Ghrelin干預(yù)各組UCP3mRNA相對表達率均顯著升高(p＜0.05);Ghrelin干預(yù)各組之間無顯著差異。
　　11、與對照組相比，0.3mM PA組和10-11M Ghrelin干預(yù)組的p-AMPKα/AMPKα

15、相對蛋白水平明顯降低(p＜0.01)，10-7M、10-9M Ghrelin干預(yù)組無顯著差異;與0.3mM PA組相比，Ghrelin干預(yù)各組p-AMPKα/AMPKα相對蛋白水平均顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著高于10-11M Ghrelin干預(yù)組(p＜0.05)。
　　12、與對照組相比，0.3mM PA組和Ghrelin干預(yù)各組UCP3相對蛋白水平均明顯降低(p＜0.05，p＜0

16、.01);與0.3mM PA組相比，10-11M Ghrelin干預(yù)組無明顯變化，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);與10-11MGhrelin干預(yù)組相比，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著升高(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、棕櫚酸(PA)可以作用于大鼠成肌細胞，使其脂肪沉積，甘油三酯含量增加，糖攝取減少，并呈劑量依賴關(guān)系。
　　2、PA誘導(dǎo)大鼠成

17、肌細胞脂肪變性的最佳濃度0.3mmol/L，最佳反應(yīng)時間12h（H組），此時細胞活力不受影響，并且細胞中有明顯的甘油三酯沉積，細胞的糖攝取顯著減低。
　　3、Ghrelin可減少大鼠成肌細胞的甘油三酯沉積，可增加高脂環(huán)境下大鼠成肌細胞的糖攝取，并且存在劑量依賴關(guān)系。
　　4、本研究證實在非胰島素存在時Ghrelin通過刺激AMPK通路直接促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，并且通過刺激AMPK磷酸化，促進UCP3活化及ACC磷酸化，從而促進大鼠