角蛋白與肝臟及胰腺疾病關(guān)系的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、第一部分肝膽道角蛋白的表達(dá)及原發(fā)性膽汁性肝硬化角蛋白基因變異的研究。 目的： 1) 了解肝膽道角蛋白的表達(dá)情況2) 探討角蛋白基因變異與原發(fā)性膽汁性肝硬化的關(guān)系方法： 從10只1個(gè)月大的FVB/n小鼠(雌雄各5只)提取肝臟、膽總管、膽囊及小腸后用高鹽提取(high salt extraction，HSE)和蛋白質(zhì)印跡免疫(western blot)法分析角蛋白表達(dá)譜。 2) 提取來自意大利米蘭的原發(fā)性

2、膽汁性肝硬化病人(209例)和健康獻(xiàn)血者(200例)外周全血基因組DNA，用K8/K18/K19全部外顯予引物行遞減聚合酶鏈反應(yīng)(Touchdown PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用變性高效液相色譜(denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC)分析，對有色譜峰改變的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后通過測序分析確定變異部位并分析變異位點(diǎn)在同類角蛋白和不同種屬生物的保守性，最后經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定角蛋

3、白基因變異與原發(fā)性膽汁性肝硬化的關(guān)系。 結(jié)果： 1) 膽總管主要表達(dá)K8/K18/K19，也表達(dá)少量K7。肝臟、膽總管、膽囊、小腸均以K8表達(dá)為主，K18從肝臟到小腸依次減少而K19則相反。K20主要見于小腸，在膽總管僅見小量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)┮姼闻K表達(dá)K7。 2) PBC組和對照組發(fā)現(xiàn)6個(gè)有意義的錯(cuò)義變異，包括K8 3個(gè)(G62C、R341H、V380I)、K18 1個(gè)(R411H)、K19 2個(gè)(G17S、V

4、229M)。 3) 發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的角蛋白變異，包括3個(gè)有意義的錯(cuò)義變異(K18 R411H、K19 G17S和K19 V229M)，1個(gè)同義變異(K19 N184N)，其中K19 V229M僅見于對照組。K19 G17S位于角蛋白結(jié)構(gòu)的頭部而K18 R411H位于的尾部，K19 G17S是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18 R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 4) 209例PBC中，能成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增

5、的有203例，有意義的錯(cuò)義變異17例，變異率為8.37﹪(17/203)，以K8 R341H最為頻繁(47.1﹪，8/17)，其次是K8 662C(23.5﹪，4/17)，7例為單一雜合子變異，10例病人存在混合變異，即K18 R411H+K18S230T和K19 G17S+IVS2+38G→A混合變異各1例，全部(8例)K8 R341H變異均獨(dú)特地伴隨K8IVS7+lODel變異。對照組外顯子變異4例，變異率為2﹪，內(nèi)含子變異3例，全

6、部(3例)K8R341H變異也伴隨K8 IVS7+10Del變異。病例組與對照組角蛋白變異率有顯著性差異(p=0.0059，OR=4.47，CI=1.48-13.56)。 結(jié)論： 1)肝膽道上皮細(xì)胞主要表達(dá)K8、K18、K19。 2)角蛋白基因變異伴隨原發(fā)性膽汁性肝硬化，是發(fā)病的易患因素之一。 3)新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義變異分別位于角蛋白的頭部和尾部，K19 G17S是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18

7、R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 創(chuàng)新及意義： 1.首次分析小鼠膽總管角蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)膽總管主要表達(dá)K8/K18/K19，僅少量表達(dá)K7，該結(jié)果為研究角蛋白在膽總管的功能及其相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)。 2.首次同時(shí)分析原發(fā)性膽汁性肝硬化病人3種角蛋白(K8/K18/K19)的全部編碼基因，發(fā)現(xiàn)角蛋白變異伴隨原發(fā)性膽汁性肝硬化，提示角蛋白變異是發(fā)病的易患因素。 3.發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的角蛋白變異伴隨原發(fā)

8、性膽汁性肝硬化，即K19 G17S和K18 R411H，分別位于角蛋白主干結(jié)構(gòu)的頭和尾部，K19 G17S是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的K19角蛋白有意義變異，而K18 R411H是首次發(fā)現(xiàn)位于K18尾部的變異。 第二部分角蛋白基因敲除或突變對胰腺腺泡細(xì)胞影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 目的：用無偏差的方法分析角蛋白基因敲除動(dòng)物胰腺基因表達(dá)譜以揭示是否存在角蛋白功能性替代基因。 方法： 1.先用基因芯片分析(Microarry a

9、ssay)缺乏角蛋白表達(dá)的12只K8裸鼠胰腺基因譜(用K8野生鼠作為參照)，并用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)方法驗(yàn)證所得結(jié)果。 2.根據(jù)基因芯片分析結(jié)果，針對改變明顯的基因，選擇具特異性的多肽序列免疫兔產(chǎn)生相應(yīng)的抗小鼠抗體以檢測蛋白的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物以行PCR擴(kuò)增或合成探針以檢測mRNA的表達(dá)及分布。 3.對已建立的角蛋白缺失(K8或K8或K19裸鼠)、角蛋白絲異常(K18 R89C

10、突變小鼠)、角蛋白磷酸化位點(diǎn)突變(K18 S33A、K18 S52A小鼠)等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，每一鼠系用2-4只小鼠，并用相應(yīng)的正常鼠作為對照，通過用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(real timeRT-PCR)、免疫印跡分析(Western Blot)等方法進(jìn)一步分析基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)的有明顯改變的基因在胰腺組織的表達(dá)。 4.用Balb/c小鼠、K8-null、K8-WT鼠建立兩種急性胰腺炎模型，然后用原位雜交(insitu hybrid

11、ization，ISH)、免疫印跡分析(western Blot)等方法分析基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)的有明顯改變的基因在這些炎癥組織的分布和表達(dá)。兩種急性胰腺炎模型是分別由膽堿缺乏性飲食(choline-deficient diet，CDD)所誘導(dǎo)的壞死出血性急性胰腺炎和由雨蛙肽(caerulein)所誘導(dǎo)的間質(zhì)水腫性急性胰腺炎，所用小鼠年齡和性別相匹配。CDD飲食誘導(dǎo)模型的建立是：21-25天大、14-19g重的雌性Balb/c小鼠禁食12-

12、16小時(shí)后予正常飲食(對照組)或喂飼含0.5﹪乙硫氨酸(ethionine)的膽堿缺乏性飲食，3天后換成正常飲食。caertllelin誘導(dǎo)模型的建立是：予Balb/c小鼠、K8一null、K8-WT鼠禁食(不禁水)12-16小時(shí)后腹腔注射生理鹽水(對照組)或50μg/kg caerulein，每小時(shí)1次共7次。在實(shí)驗(yàn)指定的時(shí)間點(diǎn)用CO<,2>吸入法處死動(dòng)物取出胰腺，每一時(shí)間點(diǎn)含2只小鼠。 結(jié)果： 1) 與K8-WT鼠

13、比較，K8-null鼠胰腺呈現(xiàn)代償性基因譜改變，Reg家族基因上調(diào)，以胰島源性再生因子-Ⅱ(regenerating islet-derived，Reg-Ⅱ)最明顯。 2) Reg-TT是主要的胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)物，除mRNA水平增加外，其蛋白水平也在K8-null鼠明顯增加。 3) Reg-TT不僅在K8缺乏時(shí)上調(diào)，也在胞漿角蛋白絲缺乏(K18-null鼠)、胞漿角蛋白絲中斷(K18 R89C)、K18$52A磷酸化定

14、點(diǎn)突變的情況下被誘導(dǎo)。 4) Reg-Ⅱ在兩種急性胰腺炎模型明顯上調(diào)。 5) 在Reg家族中，Reg-TT呈選擇性誘導(dǎo)，Reg-Ⅰ所受影響不如Reg-Ⅱ。 結(jié)論： 角蛋白缺乏或突變誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞Reg-Ⅱ明顯上調(diào)，提示Reg-Ⅱ可能功能性地補(bǔ)償胰腺腺泡細(xì)胞缺失或異常的角蛋白，是角蛋白異常時(shí)激惹的一種替代反應(yīng)產(chǎn)物以應(yīng)對外分泌胰腺的損傷。 創(chuàng)新及意義： 1.產(chǎn)生的免抗小鼠Reg-Ⅱ抗體

15、是首次報(bào)道的特異性識(shí)別Reg-Ⅱ的多克隆抗體，為Reg-Ⅱ的研究提供了有用的工具。 2.發(fā)現(xiàn)胰島源性再生因子Ⅱ(Reg-Ⅱ)在胰腺外分泌細(xì)胞角蛋白缺乏、角蛋白絲中斷、磷酸化位點(diǎn)異常時(shí)明顯過表達(dá)，在角蛋白缺乏的急性炎癥性損傷的胰腺組織表達(dá)更為顯著，首次揭示了Reg-Ⅱ與角蛋白在胰腺組織的關(guān)系，提示Reg-Ⅱ可能功能性地替代異常的角蛋白以維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整以及應(yīng)對組織的損傷，說明胰腺組織損傷時(shí)可能存在基因間相互調(diào)節(jié)的自我保護(hù)機(jī)