甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)RNA干擾載體的構(gòu)建及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）是危害甘薯的主要病毒之一，SPCSV能與多種病毒共侵染甘薯形成協(xié)同病害。通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)成為防治植物病毒病的行之有效的措施。近年來，又出現(xiàn)了一種基于人工小RNA（amiRNA）干擾技術(shù)的抗病毒轉(zhuǎn)基因新策略，該技術(shù)具有抗性水平高、穩(wěn)定性強、安全性高等多種特點。SPCSV編碼一個Ⅲ型的RNA內(nèi)切酶（RNase3），推測其為病毒編碼的基因沉默抑制子。本項研究擬構(gòu)建RNase3基因的

2、干擾載體和植物表達載體，利用RNAi技術(shù)的原理，探索RNase3基因的功能。獲得的主要結(jié)果如下：（1）以SPCSV西非株系（SPCSV WA）的RNase3基因為目的基因，構(gòu)建了其植物表達載體和干擾載體。將RNase3基因以反向重復(fù)的方式克隆到pBlue NiRIntron載體的內(nèi)含子兩側(cè)，再將含有內(nèi)含子的反向重復(fù)片段插入到中間載體pROK219上，最后將“35S啟動子-反向重復(fù)片段-NOS終止子”的片段克隆到植物表達載體pBin19上

3、，成功構(gòu)建了SPCSV RNase3基因的hpRNA干擾載體pBin19 Ri。
　?。?）同時，將RNase3完整基因克隆至pROK219上，再將含“35S啟動子-RNase3-NOS終止子”的片段克隆至pBin19上，成功構(gòu)建了SPCSV RNase3基因的植物表達載體pBin19 R3。（3）利用WMD3平臺設(shè)計并篩選amiRNA，通過改造擬南芥前體miR159a為pre-amiR159a-R3，使之可以表達靶向RNase3

4、的amiRNA，人工合成該基因并克隆至載體PBI121上，成功構(gòu)建了RNase3基因的amiRNA干擾載體PBI121 amiR。
　?。?）以上載體經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將載體轉(zhuǎn)入普通煙草K326中。目前已經(jīng)獲得部分再生植株，其中轉(zhuǎn)化表達載體pBin19的煙草14株，轉(zhuǎn)化發(fā)卡RNA（hairpin RNA，hpRNA）干擾載體pBin19 Ri的煙草14株，轉(zhuǎn)化amiRNA干擾載體PBI1