神經(jīng)介素U2受體激動劑先導分子在Caco-2細胞中的攝取和轉(zhuǎn)運特征.pdf

1、神經(jīng)介素U2受體(NMU2R)是神經(jīng)介素U(Neuromedin U)在中樞表達的一個受體,對NMU中樞介導的攝食行為和機體能量代謝平衡有重要的調(diào)控作用,是一個潛在的代謝行疾病(如肥胖癥、2型糖尿病等)重要基因靶標。運用化學生物學手段來尋找和發(fā)現(xiàn)NMU2R高選擇性激動劑,并以它們?yōu)樘结樕钊胙芯恐袠蠳MU信號轉(zhuǎn)導途徑,對了解代謝性疾病的發(fā)病機制以及對治療這些疾病藥物研發(fā)都有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。我們研究所在前期運用NMU2R激動劑高通

2、量篩選技術從中草藥天然化合物庫中篩選出了能有效激活NMU2R的小分子天然物質(zhì)EUK2000和EUK2010。肥胖大鼠體內(nèi)研究證明,這些化合物能夠降低體重,降低血糖水平和改善胰島素敏感性。對這些小分子天然物質(zhì)以及對其結(jié)構(gòu)進行修飾而得到的NMU2R激動劑先導分子(如EUK2030和EUK2085)進行藥物臨床前研究具有重要意義。 P-糖蛋白以及與多藥物抵抗相關蛋白(MRP)在體內(nèi)發(fā)揮著重要的藥物抵抗功能。很多化合物可以和這些蛋白相互

3、作用,影響到它們在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的過程。我們對上述NMU2R激動劑先導分子(EUK化合物)的在小腸的吸收情況以及與P-糖蛋白和MRP蛋白之間的相互作用還不清楚。 本文旨在培養(yǎng)Caco-2細胞來模擬人類小腸,運用HPLC、鈣黃綠素體系以及RT-PCR等技術,從細胞、基因和蛋白水平較全面考察這些先導分子在Caco-2細胞上的攝取轉(zhuǎn)運特征及與P-糖蛋白和MRP蛋白之間的相互作用。 1.NMU2R激動劑在Caco-

4、2細胞上的攝取特征 為考察NMU2R激動劑在Caco-2細胞上的攝取特征,將不同濃度NMU2R激動劑和或不和P-糖蛋白的特異性抑制劑維拉帕米在Caco-2細胞上共同作用60分鐘后,超聲破碎細胞,HPLC法定量檢測細胞內(nèi)這些化合物的攝取量。結(jié)果顯示,EUK2000、EUK2030和EUK2085均可被Caco-2細胞攝取,且攝取量與初始濃度顯著相關,說明它們是以被動轉(zhuǎn)運的方式被Caco-2細胞攝取的；與維拉帕米共同作用時,細胞攝取

5、的量均顯著增加,說明它們都是P-糖蛋白的底物。而EUK2010不能被Caco-2細胞攝取。 2.NMU2R激動劑在Caco-2細胞上的轉(zhuǎn)運 為考察NMU2R激動劑在人類小腸的吸收情況,在插入式培養(yǎng)皿上種植Caco-2細胞,培養(yǎng)21天后,模擬人類小腸進行EUK化合物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗,HPLC法定量分析。結(jié)果表明,EUK2085在Caco-2細胞上較易通透,其表觀通透系數(shù):Papp=1.54×10-5cm/s。而EUK2000

6、、EUK2010及EUK2030均不能在Caco-2細胞上轉(zhuǎn)運。 3.NMU2R激動劑對Caeo-2細胞上MDR1,MRP1和MRP2基因表達的影響 為考察NMU2R激動劑對Caco-2細胞上與藥物抵抗有關基因表達的影響,將不同濃度的NMU2R激動劑分別作用于Caco-2細胞48和72小時后,提取RNA,并反轉(zhuǎn)成cDNA,再采用RT-PCR的技術進行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EUK2000對MDR1,MRP1和MRP2基因表達均具

7、抑制作用,而EUK2030和EUK2085均可上調(diào)MDR1、MRP1和MRP2基因的表達。而EUK2010對MDR1、MRP1基因表達無影響。 4.NMU2R激動劑先導分子對P-糖蛋白和/或MRP蛋白的抑制作用 為考察NMU2R激動劑對Caco-2細胞上P-糖蛋白和/或MRP蛋白有無抑制作用,我們利用了鈣黃綠素體系(calcein AM assay)。結(jié)果顯示,EUK2000和EUK2085均對P-糖蛋白或MRP蛋白有抑