中國(guó)原產(chǎn)華東葡萄及其子代抗白粉病基因cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST序列分析.pdf

1、葡萄白粉病[Uncinulanecator(Schw.)Burr.]是一種世界性真菌病害，給葡萄生產(chǎn)造成很大損失，培育抗病品種是控制葡萄白粉病的經(jīng)濟(jì)有效的途徑。中國(guó)野生葡萄不僅具有抗病性，而且可以很好的遺傳給后代，原產(chǎn)我國(guó)野生種華東葡萄(VitispseudoreticulataW.T.Wang)株系“白河-35-1”，經(jīng)多年研究證明它對(duì)葡萄白粉病表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗病性，在其后代中“6-12-4”對(duì)白粉病也有較強(qiáng)的抗性；對(duì)其抗白粉病相關(guān)基因

2、進(jìn)行克隆研究不僅有利于闡明抗病機(jī)制，而且對(duì)葡萄抗白粉病研究及抗病基因的育種利用具有重要價(jià)值。本研究運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建中國(guó)野生抗病葡萄cDNA文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以期獲得與抗病有關(guān)的EST序列和抗病相關(guān)基因。取得如下主要結(jié)果： 1.以中國(guó)野生華東葡萄株系“白河-35-1”為材料，于2006年7月7日，在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)；用病葉壓片法人工接種葡萄白粉病病原菌，接種后

3、立即套袋。在接種后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d剪去幼葉葉片，立即放置液氮中，用SDS/酚法提取總RNA；用不同接種時(shí)間白粉病病原菌[Unecator(Schw.)Burr.]誘導(dǎo)的葉片分別提取總RNA，然后混合提取的RNA樣形成總RNA構(gòu)建中國(guó)野生華東葡萄“白河-35-1”葉片cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)，原始文庫(kù)滴度為3.0x106pfu/ml，重組率為98.0％，擴(kuò)增文庫(kù)滴度為1×109pfu/ml，重組率為97％，插入片段主要

4、分布在0.5-3.0kb之間，平均大小為1000bp左右。 2.以中國(guó)野生華東葡萄株系“白河-35-1”后代較抗病的株系“6-12-4”為材料，接種、取材、RNA的提取方法同“白河-35-1”，構(gòu)建中國(guó)野生華東葡萄株系“6-12-4”葉片cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)，原始文庫(kù)滴度為2×106pfu/mlpfu/ml，重組率為98％，擴(kuò)增文庫(kù)滴度為8×108pfu/mlpfu/ml，重組率為97％，插入片段主要分布在0.5-3.0kb之間

5、，平均大小為1000bp左右。 3.通過(guò)對(duì)’6-12-4”文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序，獲得了181條質(zhì)量好的cDNA序列，登Gen-Bank(登錄號(hào)為FG579859-FG580039)；利用Blastx程序?qū)⑵渲械?14條cDNA序列與GenBank的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，78條EST序列與13類(lèi)功能已知基因同源性有關(guān)；35條EST序列屬于功能未知基因的片段；其余1條EST序列在GenBank中未檢索到任何同源序列。在配準(zhǔn)己知基因的78

6、條cDNA序列中，20條EST序列與假定的抗病相關(guān)基因同源性很高。這些抗病相關(guān)基因包含于抗病反應(yīng)的主要過(guò)程中，結(jié)果如下：包括與抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的含有TPR結(jié)構(gòu)域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、鈣調(diào)素、MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子、組氨酸/天冬氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶等；與防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的蛋白酶類(lèi)如糖基水解酶家族、病程相關(guān)蛋白14、富含亮氨酸蛋白、細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶等，與基礎(chǔ)防御和非寄主抗性有關(guān)的金屬硫蛋白、環(huán)化酶類(lèi)、熱激蛋白-9

7、0、查爾酮-黃酮類(lèi)異構(gòu)酶、；參與脅迫誘導(dǎo)的富含脯氨酸蛋白、ABA脅迫蛋白、紫外光抑制蛋白以及在抗病過(guò)程中與細(xì)胞自我保衛(wèi)相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑和細(xì)胞壁物質(zhì)纖維蛋白。這些物質(zhì)在植物的抗病過(guò)程中起著重要作用。 4.通過(guò)對(duì)“白河-35-1”文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序，得到1019個(gè)一致序列，其中包括785個(gè)單一序列，234個(gè)拼接序列。序列的生物信息學(xué)分析正在進(jìn)行中。 5.在中國(guó)野生華東葡萄“6-12-4”cDNA文庫(kù)獲得一條全長(zhǎng)鈣調(diào)素基因