功能性自組裝多肽納米纖維凝膠支架聯(lián)合兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療兔椎間盤退行性變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 功能性多肽的合成及功能性多肽自組裝成納米纖維凝膠
　　目的:設(shè)計(jì)合成含有連接蛋白核心序列 Link N的功能性多肽兩親性分子 RLN,研究其自組裝形成凝膠支架的超微結(jié)構(gòu)。
　　方法:將 RADA16和RLN多肽分別溶解于10％無(wú)菌蔗糖溶液中,濃度為1％(10mg/ml, m/v),將 RADA16與 RLN多肽溶液等比例混合(1:1)并用等體積細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12溶

2、液觸發(fā)多肽自組裝,原子力顯微鏡檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功合成 RADA16和RLN多肽兩親性分子,多肽溶液 RLN與 RADA16(1:1)混合自組裝形成凝膠。原子力顯微鏡檢測(cè)顯示:單獨(dú) RLN多肽不能自組裝形成納米纖維,RADA16和RLN混合多肽(1:1)自組裝形成納米纖維,直徑 D=31.9±3.8 nm,長(zhǎng)度可達(dá)到幾微米。
　　結(jié)論:多肽 RADA16和RLN可以自組裝形成納米級(jí)凝膠支架(RLN/RADA16, LN-N

3、S),其可以作為髓核組織工程的生物支架材料。
　　第二部分 功能性自組裝多肽納米纖維凝膠支架對(duì)髓核細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:研究自行設(shè)計(jì)的新型、功能性 LN-NS凝膠支架對(duì)兔髓核細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:取3周齡普通級(jí)日本大耳白兔,無(wú)菌條件下取其胸腰段椎間盤髓核組織,Ⅱ型膠原酶消化提取髓核細(xì)胞,透射電鏡鑒定髓核細(xì)胞。在 RLN/RADA16多肽混合溶液和RADA16多肽溶液中加入等量細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM/

4、F12溶液,觸發(fā)形成 LN-NS和RADA16凝膠支架。收集兔髓核細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞接種于多肽凝膠支架材料的內(nèi)部或表面,鈣黃綠素/碘化丙啶(Calcein-am/PI)檢測(cè)細(xì)胞在凝膠內(nèi)部的存活情況,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞三維遷移情況,CCK-8試劑盒檢測(cè)凝膠支架材料對(duì)髓核細(xì)胞的黏附情況,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)髓核細(xì)胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型膠原 mRNA的表達(dá),觀察功能性功能性 LN-NS凝膠支架的細(xì)胞學(xué)毒性及

5、對(duì)髓核細(xì)胞黏附、三維遷移及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響。
　　結(jié)果:髓核細(xì)胞貼壁后呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng),細(xì)胞分為兩類:圓形或類圓形的脊索細(xì)胞,梭形或多角形的類軟骨細(xì)胞。透射電鏡顯示兩種細(xì)胞內(nèi)均由大量糖原聚集,其中脊索細(xì)胞中含有大小不等的囊泡。Calcein-am/PI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)功能性 LN-NS凝膠支架無(wú)明顯的細(xì)胞學(xué)毒性;激光共聚焦顯微鏡三維重建圖像證實(shí)功能性 LN-NS凝膠支架明顯促進(jìn)了髓核細(xì)胞向凝膠材料內(nèi)部的遷移;CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)功能性

6、 LN-NS凝膠支架較 RADA16凝膠支架明顯促進(jìn)了細(xì)胞的黏附;RT-PCR檢測(cè)證實(shí)功能性 LN-NS凝膠支架明顯促進(jìn)了髓核細(xì)胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型膠原 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:成功分離培養(yǎng)兔椎間盤髓核細(xì)胞;功能性自組裝多肽納米纖維凝膠材料 LN-NS具有良好的細(xì)胞相容性和生物學(xué)活性,具有支架和生物活性雙重作用,可作為椎間盤組織工程支架材料。
　　第三部分 功能性自組裝多肽納米纖維凝膠支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的

7、影響
　　目的:研究自行設(shè)計(jì)的功能性 LN-NS凝膠支架對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生物學(xué)行為的影響。
　　方法:取5周齡普通級(jí)日本大耳白兔股骨骨髓,淋巴細(xì)胞分離液法分離純化 BMSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD44、CD29、CD34、CD45等表面抗原的表達(dá)。收集第三代兔 BMSCs,制備單細(xì)胞懸液,將 BMSCs接種于 LN-NS(實(shí)驗(yàn)組)和RADA16(對(duì)照組)多肽凝膠支架材料的表面,鈣黃綠素/碘化丙啶(Calce

8、in-am/PI)檢測(cè)凝膠材料對(duì) BMSCs的毒性情況,CCK-8試劑盒檢測(cè)凝膠支架材料對(duì)髓核細(xì)胞的黏附及增殖情況,免疫熒光檢測(cè) BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)(Ⅱ型膠原)的分泌情況,觀察功能性 LN-NS凝膠支架對(duì)兔BMSCs生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:純化細(xì)胞貼壁后呈形態(tài)均一的長(zhǎng)梭形或紡錘形,旋渦狀生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)法顯示:純化細(xì)胞高表達(dá) CD29、CD44,陽(yáng)性率分別為88.1％和96.2％;低表達(dá) CD34、CD45,陽(yáng)性率分別

9、為3.9％、4.4％。Calcein-am/PI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)功能性 LN-NS多肽凝膠支架與 RADA16凝膠支架具有相似的細(xì)胞學(xué)毒性;CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)功能性 LN-NS多肽凝膠支架較 RADA16凝膠支架明顯促進(jìn)了細(xì)胞的黏附;免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在功能性 LN-NS多肽凝膠支架上的細(xì)胞Ⅱ型膠原分泌高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:成功分離培養(yǎng)兔 BMSCs;功能性 LN-NS多肽凝膠材料具有良好的細(xì)胞相容性和生物學(xué)活性,是一種有前途的

10、髓核組織工程材料。
　　第四部分 功能性自組裝多肽納米纖維支架聯(lián)合兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療兔椎間盤退行性變的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察功能性 LN-NS多肽凝膠材料與兔 BMSCs聯(lián)合移植治療兔椎間盤退行性變的效果。
　　方法:采用纖維環(huán)穿刺髓核抽吸法制作兔椎間盤退變模型。取2.0-2.5kg日本大耳白兔12只,對(duì)兔脊柱 L2-3、L3-4、L4-5三個(gè)節(jié)段椎間盤分別干預(yù)如下:L2-3,僅纖維環(huán)穿刺抽吸髓核組織;L3-4,

11、抽吸髓核組織后注入包被 BMSCs的RADA16凝膠支架;L4-5,抽吸髓核組織后注入包被 BMSCs的功能性 LN-NS凝膠支架。L1-2節(jié)段作為空白對(duì)照。術(shù)前及術(shù)后3周所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均行脊柱全長(zhǎng)核磁共振(MRI)檢查,檢測(cè)椎間盤信號(hào)的改變。3周后處死兔,取其干預(yù)節(jié)段椎間盤,石蠟包埋、切片,HE染色觀察髓核組織內(nèi)細(xì)胞情況,免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,干預(yù)節(jié)段椎間盤均發(fā)生不同程度改變。L2-3節(jié)段椎

12、間盤信號(hào)％ST2WI值較3周前相比明顯下降(p﹤0.05);L3-4節(jié)段椎間盤信號(hào)％ST2WI值較3周前相比下降;L4-5節(jié)段椎間盤信號(hào)％ST2WI值較3周前輕度下降。HE染色顯示:凝膠支架和BMSCs聯(lián)合移植后(L3-4,L4-5),髓核組織細(xì)胞數(shù)量明顯增多;免疫組化染色顯示:L1-2、L3-4、L4-5髓核組織內(nèi)均可見大片棕色區(qū)域,其間散在棕色顆粒,黃染陽(yáng)性的類軟骨細(xì)胞分散于基質(zhì)中,染色深度以 L1-2、L4-5節(jié)段髓核組織最為明顯