同種異體骨髓間充質干細胞治療兔橈骨骨折不愈合的實驗研究.pdf

1、盡管骨科近年來發(fā)展迅速，但骨折不愈合仍是臨床中面臨的一個重要問題，在正常的骨折愈合過程中，未分化的骨髓間充質干細胞在骨形態(tài)蛋白(BMPs)和調(diào)節(jié)因子的影響下增值，分化成軟骨細胞和骨細胞，最終形成骨，達到修復損傷。然而一部分骨折沒有由于沒有完成修復過程，最終導致延遲愈合或者不愈合，增加手術次數(shù)，延長住院時間。骨折不愈合的診斷是建立在一系列臨床癥狀和物理檢查上的，它包括疼痛，骨折端的活動以及放射學檢查。骨折治療6－8個月后仍沒有愈合考慮骨折

2、不愈合，不同部位的發(fā)病率約5％-20％。
　　 近年來隨著干細胞培養(yǎng)、分離等技術的發(fā)展使骨折不愈合的治療有了更多的選擇。從骨髓提取分離、純化間充質干細胞(mesenehymalstemcells，MSCs)能演變?yōu)槎喾N組織細胞，在多種因素的刺激下可分化為幾乎各種中胚層細胞，如骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，可作為各種組織修復的選擇。本實驗即以同種異體兔骨髓間充質干細胞修復兔骨折不愈合模型，觀察其修復兔橈骨骨折不愈合模型的效果，從而

3、探討同種異體MSCs的體內(nèi)修復骨折不愈合的機制，為進一步使用同種異體MSCs治療骨折不愈合提供實驗支持。
　　 目的：
　　 研究兔骨髓間充質干細胞的體外分離、培養(yǎng)、純化方法，以及觀察兔骨髓間充質干細胞生長情況。用兔橈骨制作骨折不愈合的模型。通過骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)擴增，治療兔橈骨骨折不愈合模型，研究骨髓間充質干細胞移植治療骨折不愈合的效果及機制，以及不同數(shù)量的細胞移植對骨折不愈合的影響。從而進一步為人自體、異體骨髓間

4、充干細胞的體外培養(yǎng)應用治療骨折不愈合提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、用Brownlow法制做新西蘭大白兔橈骨骨折不愈合模型，將其一側橈骨干中遠1/3截斷，去除5mm骨質及骨膜，用骨蠟封閉骨折端，使骨折保持5mm的間隙。術后8周，使其形成兔橈骨萎縮性骨折不愈合的模型。
　　 2、采用貼壁篩選法從兔股骨近端髓腔骨髓組織中分離、純化BMSCs，進行體外培養(yǎng)擴增，應用免疫組化染色方法對細胞表型、純度進行鑒定。

5、　　 3、將培養(yǎng)的細胞低溫保存，待骨折不愈合模型完成后，復蘇MSCs，擴增培養(yǎng)，消化培養(yǎng)瓶中的細胞，PBS洗滌后，計數(shù)，制成細胞濃度為1×106/ml的細胞懸液，將骨折不愈合模型隨機分為3組，A組給予不愈合部位0.2ml細胞懸液注射。B組給予不愈合部位0.4ml細胞懸液注射。C組不愈合部位僅打通髓腔。分別在給予MSCs移植治療4周和8周行X線檢查，觀察骨折愈合情況。
　　 結果：
　　 1、骨折不愈合模型制作術后8周，

6、影像學和組織學檢查，其形成類似于臨床萎縮性骨折不愈合的模型。
　　 2、培養(yǎng)的兔骨髓間充質干細胞貼壁生長，細胞多為為短梭形或紡錘形，典型的為漩渦狀排列，比較均一；采用免疫細胞化學檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞表達細胞表面抗原CD44，不表達CD34，證實所培養(yǎng)的細胞為兔BMSCs。
　　 3、BMSCs移植治療骨折不愈合術后8周行X線檢查和組織學顯示：A組中7只兔橈骨骨折愈合，3只未愈合；B組中9只兔橈骨骨折愈合，1只未愈合；C組中