Ghrelin在烏珠穆沁羊雌性生殖道內(nèi)的表達(dá)及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、Ghrelin是1999年發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體，其最主要功能是通過(guò)與GHSR結(jié)合刺激生長(zhǎng)激素的釋放。最近發(fā)現(xiàn)生殖器官中有Ghrelin分布，提示其與生殖周期的調(diào)節(jié)和妊娠有重要關(guān)系。雌、孕激素對(duì)雌性生殖系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，二者與Ghrelin表達(dá)之間是否有關(guān)尚無(wú)定論。目前未見(jiàn)有關(guān)于Ghrelin在烏珠穆沁羊生殖道內(nèi)的研究報(bào)道。本文在獲得烏珠穆沁羊Ghrelin(usGhl)cDNA全序列的基礎(chǔ)上，對(duì)生殖道

2、各組織Ghrelin mRNA進(jìn)行定位；系統(tǒng)研究了Ghrelin基因在不同發(fā)情期和妊娠期的烏珠穆沁羊雌性生殖道各組織內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量及其與外周血中雌激素和孕酮之間的相互關(guān)系；利用體外培養(yǎng)的烏珠穆沁羊輸卵管上皮細(xì)胞研究雌、孕激素對(duì)Ghrelin基因表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用；建立usGhl真核表達(dá)體系，初步證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。本論文為反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高奠定基礎(chǔ)。 1.根據(jù)GenBank報(bào)道的Ghrelin cDNA序列

3、設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù)成功克隆了usGhl cDNA全序列。本研究擴(kuò)增的usGhl cDNA序列全長(zhǎng)634bp，包含由116個(gè)氨基酸編碼的前原烏珠穆沁羊Ghrelin肽。使用Blast網(wǎng)頁(yè)和DNAStar軟件對(duì)得到的usGhl cDNA全序列進(jìn)行分析，無(wú)論是cDNA序列還是預(yù)測(cè)的成熟肽序列都與其它哺乳動(dòng)物具有較高同源性。本研究結(jié)果表明Ghrelin基因在不同動(dòng)物間表現(xiàn)出較高保守性。 2.將烏珠穆沁羊子

4、宮體Ghrelin RT-PCR產(chǎn)物回收并進(jìn)行地高辛探針標(biāo)記，用于原位雜交技術(shù)檢測(cè)Ghrelin mRNA在烏珠穆沁羊子宮體、輸卵管、宮頸、陰道中的表達(dá)位置。結(jié)果為:Ghrelin mRNA在內(nèi)(黏)膜層的上皮細(xì)胞和腺體中大量表達(dá)，在固有層和肌層少量表達(dá):肌肉組織、結(jié)締組織和外膜層不表達(dá)。說(shuō)明在綿羊雌性生殖道各組織中，Ghrelin mRNA主要表達(dá)于內(nèi)(黏)膜表層細(xì)胞。 3.運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí)Ghrelin基因在烏珠穆沁

5、羊子宮體、輸卵管、子宮頸、陰道組織內(nèi)均有表達(dá)且表達(dá)量不同:子宮體表達(dá)量最高，輸卵管次之，子宮頸和陰道內(nèi)的表達(dá)量最少。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及激素電化學(xué)發(fā)光測(cè)定法研究了烏珠穆沁羊發(fā)情及妊娠期生殖道各組織Ghrelin基因表達(dá)量與體內(nèi)雌、孕激素之間的關(guān)系。本研究中血清雌二醇和孕酮在發(fā)情及妊娠期的濃度變化符合家畜生理周期的一般規(guī)律。烏珠穆沁羊生殖道各組織Ghrelin基因的表達(dá)量隨發(fā)情周期及是否妊娠發(fā)生規(guī)律性改變。其中子宮體、子宮頸和輸卵

6、管內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)與雌二醇及孕酮濃度的變化基本呈正相關(guān)。陰道內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)與雌二醇及孕酮濃度的變化沒(méi)有相關(guān)性。 4.將機(jī)械法、細(xì)胞沉降及密度梯度離心結(jié)合使用，成功獲得了原代和傳代培養(yǎng)的烏珠穆沁羊輸卵管上皮細(xì)胞。傳一代的輸卵管上皮細(xì)胞分別添加不同濃度的17-β-雌二醇和孕酮，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后用RQ-PCR方法檢測(cè)Ghrelin基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示:17-β-雌二醇和孕酮對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊輸卵管

7、上皮細(xì)胞具有促進(jìn)貼壁和促生長(zhǎng)作用；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Ghrelin基因表達(dá)無(wú)影響；一定濃度的17-β-雌二醇和孕酮對(duì)培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。 5.培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞添加不同濃度他莫昔芬或米非司酮后再用17-β-雌二醇或孕酮刺激輸卵管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)24h、48h、72h。使用RQ-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞Ghrelin基因表達(dá)情況。結(jié)果表明:他莫昔芬和米非司酮能夠抑制培養(yǎng)的烏珠穆沁羊輸卵管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；一

8、定濃度他莫昔芬能降低17-β-雌二醇刺激的輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)，一定濃度米非司酮能降低孕酮刺激的輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)，且二者的抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)量無(wú)影響。說(shuō)明雌、孕激素能夠促進(jìn)培養(yǎng)的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)，雌、孕激素是通過(guò)與其受體相結(jié)合發(fā)揮作用。 6.本論文成功構(gòu)建了Ghrelin真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-us