miR-29異常減少在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的: 近來(lái)的研究表明，miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c，miR-29s)是一種重要的抑瘤微小RNA（TS-miRNA），其表達(dá)異常減少與多種顱外惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)及細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK6)是miR-29家族的潛在靶基因，且兩者表達(dá)水平隨多種腫瘤惡性程度升高而相應(yīng)增加。但是，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-29s及其上述靶基因的表達(dá)有何改變，其與膠

2、質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的關(guān)系及在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及如何，尚不清楚。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDC42和CDK6是否是miR-29s的天然靶基因，miR-29s敲低上述靶基因表達(dá)的機(jī)制如何尚需進(jìn)一步證實(shí)。此外，外源性miR-29s對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖、凋亡和細(xì)胞周期分布有何影響，miR-29s特異性敲低CDC42和CDK6表達(dá)是否是其發(fā)揮上述抑瘤作用的分子機(jī)制亦需觀察驗(yàn)證。本研究以不同級(jí)別人膠質(zhì)瘤標(biāo)本和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，對(duì)上述問(wèn)題

3、進(jìn)行研究。
　　 方法: ①采用鎖定寡核苷酸探針原位雜交及免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)60例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及10例對(duì)照腦組織中miR-29a/b/c及Ki-67抗原的表達(dá)水平。②采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG及U251中驗(yàn)證CDC42是否是miR-29s的天然靶基因，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c mimics后上述細(xì)胞系CDC42 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，探索miR-29s敲低CDC42表達(dá)的分子機(jī)制。③

4、通過(guò)體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染miR-29a/b/c等量混合物（miR-29mix組）后U87MG及U251細(xì)胞侵襲遷移能力的改變;通過(guò)觀察外源性CDC42能否逆轉(zhuǎn)上述改變證實(shí)特異性敲低CDC42表達(dá)是否是miR-29s抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲的分子機(jī)制。④觀察miR-29mix組Ki-67陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)的變化及補(bǔ)充外源性CDC42對(duì)該變化的影響，對(duì)比穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-29a/b/c的各U251亞細(xì)胞系與scr過(guò)表達(dá)U251亞細(xì)胞系和U2

5、51細(xì)胞系克隆形成效率的差異，以明確miR-29對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其分子機(jī)制。⑤通過(guò)Caspase3/7活性檢測(cè)和流式凋亡檢測(cè)，觀察轉(zhuǎn)染miR-29mix后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系凋亡水平的改變及共轉(zhuǎn)染CDC42對(duì)細(xì)胞凋亡的挽救效應(yīng);比較miR-29s/CDC42通路對(duì)U87MG細(xì)胞系（p53野生型）及U251細(xì)胞系(p53突變型)凋亡誘導(dǎo)作用的差異及其對(duì)野生和突變型p53表達(dá)水平影響的差異，明確該通路調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)

6、制及其與p53結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。⑥通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-29c的SNB19膠質(zhì)瘤亞細(xì)胞系(p-miR29c)及對(duì)照無(wú)義序列過(guò)表達(dá)亞細(xì)胞系(p-scr)，觀察miR29c對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞CDK6 mRNA和蛋白表達(dá)及細(xì)胞周期分布和增殖活性的影響，探索miR-29s抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果: ①原位雜交結(jié)果顯示，WHOⅠ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組的miR-29a陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(LI％)分別為21.30±18.20、4

7、.53±2.54、1.46±0.52，并均明顯低于非腫瘤對(duì)照腦組織的LI％（46.37±26.38，P＜0.001）;miR-29b陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(LI％)分別為17.37±12.87、5.06±2.87、1.49±0.71，并均明顯低于非腫瘤對(duì)照腦組織的LI％（39.89±26.76，P＜0.001）;miR-29c陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(LI％)分別為18.93±11.94、5.54±3.81、1.77±0.95，并均明顯低于非腫瘤對(duì)照腦組織的

8、LI％（53.66±23.66，P＜0.001）;miR-29a/b/c表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的升高相應(yīng)降低，各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。而Ki-67表達(dá)水平則呈相反趨勢(shì)，對(duì)照腦組織的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞密度最低（0.00±0.00），且其表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別增加相應(yīng)升高(WHOⅠ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)組分別為9.30±3.48、31.15±9.44、60.15±13.60);各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

9、.01）。經(jīng)直線相關(guān)分析證實(shí)，miR-29a/b/c與Ki-67指標(biāo)之間呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-586、r=-625、r=-599，P＜0.01)。②熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞里，miR-29s可通過(guò)與野生型CDC42的3'UTR特異性結(jié)合，介導(dǎo)其對(duì)熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的沉默作用;因miR-29s變型CDC423'UTR結(jié)合，當(dāng)用二者共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)不能沉默熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá);從而證實(shí)CDC42是miR-29s的天然靶基因。

10、與相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞相比，miR-29s轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的miR-29a/b/c表達(dá)水平明顯升高，而CDC42 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說(shuō)明miR-29a/b/c可以通過(guò)直接降解CDC42mRNA阻斷CDC42表達(dá)。③遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-29家族可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力，外源性CDC42可部分逆轉(zhuǎn)miR-29s對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響;④miR-29mix轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Ki-67陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)LI(％)和克隆

11、形成效率均明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，補(bǔ)充CDC42后可部分逆轉(zhuǎn)miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞的LI(％)。⑤miR-29mix轉(zhuǎn)染的U87MG(p53野生型）細(xì)胞Caspase3/7活性明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，F(xiàn)CM中miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染的U87MG細(xì)胞其凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。外源性CDC42可部分降低miR-29mix mimics轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞的Caspase3/7活性及凋亡指數(shù)。而miR-29mix mi

12、mics轉(zhuǎn)染的U251（p53突變型）各細(xì)胞Caspase3/7活性及凋亡指數(shù)與對(duì)照組細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異。⑥與SNB19及SNB19-scr相比，SNB19-miR-29c G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，而S期及G2/M期比例相應(yīng)降低，同時(shí)SNB19-miR-29c的克隆形成效率亦明顯低于兩個(gè)對(duì)照（亞）細(xì)胞系。
　　 結(jié)論: ①隨著膠質(zhì)瘤惡性度的升高，miR-29a/b/c表達(dá)水平降低，而CDC42表達(dá)水平增加，二者呈顯著負(fù)相

13、關(guān)，miR-a/b/c和CDC42表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為及患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。②研究轉(zhuǎn)染miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix過(guò)表達(dá)細(xì)胞系可相應(yīng)高表達(dá)miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix，是研究miR-a/b/c抑瘤效應(yīng)的理想細(xì)胞模型③CDC42是miR-29a、miR-29b、miR-29c的天然靶基因，miR-29a、miR-29b、miR-29c可通過(guò)降解其