5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動力療法對成纖維細胞的影響以及相關(guān)分子機制的研究.pdf

1、目的:
　　 5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動力療法(5-ALA-IPL-PDT)是近年用于皮膚老化治療的一種方法。現(xiàn)有的臨床研究顯示IPL光動力療法較單純采用IPL照射，在改善皮膚老化的癥狀方面更具療效。但其中涉及的機制并不十分清楚。本實驗首先觀察IPL對小鼠皮膚膠原合成的影響，以及對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖、膠原分泌表型的影響。為后續(xù)研究摸索實驗條件并觀察功能學變化。
　　 MAPK是調(diào)控細胞增殖、分化和存活等功能的信號網(wǎng)

2、絡(luò)中心。為了研究IPL誘導的增殖與MAPK之間的關(guān)系，我們觀察不同劑量IPL輻照對體外培養(yǎng)成纖維細胞胞內(nèi)MAPK家族成員ERK、P38、JNK活性影響，以及信號蛋白活性的時相性變化。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)是細胞外基質(zhì)蛋白合成的主要刺激因子，而MMP-1是促進細胞外基質(zhì)蛋白降解的主要活性蛋白。兩者都可由成纖維細胞分泌，但兩者的功能相反。我們試圖觀察IPL如何影響兩者的分泌，以及其與細胞外基質(zhì)合成之間的關(guān)系。
　

3、　 細胞因子（如:MMP-1、TGF-β1）在IPL嫩膚治療中扮演重要的角色。然而細胞因子的分泌是首要胞內(nèi)信號通路的嚴格調(diào)控，本部分研究著重評價MAPK家族成員（ERK、 P38、 JNK）介導的信號通路對IPL誘導相關(guān)分泌表型的變化的影響和機制。
　　 在上述前期研究基礎(chǔ)上，觀察5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動力療法(5-ALA-IPL-PDT)對成纖維細胞MMP-1、TGF-β1分泌影響。同時探究上述細胞因子分泌表型變化的信號

4、機制，著重研究MAPK家族成員(ERK、P38、JNK)介導的信號通路在5-ALA-IPL-PDT治療皮膚老化中的作用機制。
　　 方法:
　　 在活體實驗中，給予褪毛小鼠梯度能量密度的IPL輻照，在不同時間點（1，3，7，14和28天）收集小鼠皮膚標本，免疫組織化學方法檢測皮膚膠原蛋白的改變和成纖維細胞增殖。
　　 同時給予體外培養(yǎng)的成纖維細胞梯度能量密度的IPL輻照,在不同時間點收集細胞，流式細胞法檢測細胞周

5、期改變;MTT法確細胞增殖變化;免疫組織化學法檢測膠原蛋白的變化。將成纖維細胞接種在12孔板中，給予梯度劑量（0、10、18、36和72 J/cm2）的IPL輻射，在輻照后不同時間點收集提取細胞全蛋白，Western blot法檢測ERK、P38和JNK磷酸化水平的變化。人皮膚成纖維細胞接種培養(yǎng)至12孔培養(yǎng)板，隨后分別給予0、10、18、36和72 J/cm2的梯度劑量IPL輻射，在輻照后24h收集上清， ELISA法檢測TGF-β1、

6、MMP-1水平的變化。
　　 在干預研究中，預先采用PD98059、SB203580和SP600125處理成纖維細胞，分別阻斷ERK、P38、JNK信號通路。收集成纖維細胞，隨后給予IPL輻照。免疫印跡法觀察這些家族成員信號的變化水平。在照射后24小時收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測TGF-β、 MMP-1水平的變化。
　　 成纖維細胞接種至培養(yǎng)板。在IPL輻照前，預先采用ALA處理細胞2小時，隨后給予成纖維細胞IPL輻

7、照。MTT法檢測光動力療法的細胞毒作用，預設(shè)合適光動力參數(shù)。免疫印跡法觀察這些家族成員信號的變化水平。在照射后24小時收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測TGF-β1、MMP-1水平的變化。實驗分組為:空白組、IPL照射組、IPL(10J)+ALA(0.5mM)、IPL(10J)+ALA(1.0mM)。
　　 結(jié)果:
　　 1)給予小鼠32J/CM2的IPL輻照僅輕度增加真皮層的厚度，但真皮膠原纖維的致密性增強

8、。表皮層改變未見顯著改變。IPL照射可促進PCNA(增殖細胞核抗原)的表達。低劑量IPL輻照體外培養(yǎng)的成纖維細胞并不能明顯促進細胞的增殖。
　　 2)實驗發(fā)現(xiàn)與無IPL處理組比較，10 J/cm2IPL輻照可輕度激活三者的磷酸化，18-72 J/cm2 IPL輻照可劑量依賴性的抑制ERK、P38和JNK磷酸化，72 J/cm2IPL輻照可最強的抑制這些信號的活化;時間組可觀察到，在照光后1小時ERK、P38、JNK磷酸化水平達到

9、峰值，隨后三者磷酸化水平降至基礎(chǔ)值之下。
　　 0-36J的IPL輻照對TGF-β1的分泌沒有明顯的促進作用，當劑量達到72 J/cm2時可觀察到TGF-β1的分泌明顯增加。IPL同時影響MMP1的分泌，與空白組比較，僅在10J劑量時可觀察到MMP1分泌輕度增加，而18-72 J/cm2的輻照對其分泌均未見明顯的影響。
　　 3) PD98059、SP600125預處理可顯著抑制成纖維細胞的ERK和JNK磷酸化，SB20

10、3580預處理未明顯改變P38磷酸化水平;2）與對照組比較，SP600125可明顯增強MMP-1的水平，平均增高254％。而PD98059、SB203580對MMP1的分泌無顯著影響;3）SB203580組可觀察到最明顯的TGF-β1分泌，分別為對照組、PD98059組和SP600125組的329.27％、567％和358％(P＜0.05)。
　　 4)高于18J IPL照射，聯(lián)合ALA濃度高于(0.5mM)預處理可產(chǎn)生顯著的細

11、胞毒效應(yīng);據(jù)此我們后續(xù)實驗光動力參數(shù)設(shè)為:IPL照劑量10J， ALA濃度為0.5-1.0mM。與空白組比較，IPL(10J)+ALA(0.5mM)組、IPL(10J)+ALA(1.0mM)組，MMP-1濃度分別增加94.7％和111.4％，而TGF-β1濃度分別降低34.8％和39.1％; IPL(10J)+ALA(0.5mM)組可觀察到最明顯的MAPK家族信號分子活性的增強，灰度分析顯示:與IPL組比較，ERK、P38和JNK分別增

12、加113.1％、36.1％和67.3％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究顯示IPL輻照可促進體內(nèi)外成纖維細胞分泌膠原蛋白，這一模型的建立為研究IPL嫩膚機制提供了功能學依據(jù)。通過觀察IPL對成纖維細胞增殖、凋亡、存活生理學水平的研究，從多個角度探討IPL嫩膚的潛在信號分子機理。
　　 高劑量的IPL輻照可下調(diào)體外培養(yǎng)成纖維細胞內(nèi)MAPK信號蛋白活性。后者對細胞增殖和分泌表型產(chǎn)生何種影響需要進一步研究。

13、IPL輻照對TGF-β1、MMP1分泌的影響具有雙向性，高劑量(72J/cm2)輻照可促進TGF-β1的分泌，較低劑量(10 J/cm2)促進MMP-1的分泌。以上研究為IPL促進成纖維細胞增殖機理和分泌表型的變化提供了新的實驗證據(jù)。
　　 IPL介導的MMP和TGF的分泌表型變化中，MAPK家族成員發(fā)揮著不同的作用。P38是TGF-β1分泌的負性調(diào)節(jié)因子;而JNK起上調(diào)作用;ERK對TGF-β1分泌無影響。JNK可增加MMP-

14、1的表達，而ERK和P38對MMP-1分泌無顯著影響。綜合以上部分的研究，我們研究顯示IPL可通過改變MAPK活性影響MMP-1和TGF-β1的分泌。除此之外潛在的替代途徑也發(fā)揮著作用。
　　 5-ALA-IPL-PDT光動力療法是對成纖維細胞是一種應(yīng)激反應(yīng)，強烈的應(yīng)激反應(yīng)可產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)。在亞細胞毒劑量范圍內(nèi)，IPL聯(lián)合光動力療法顯著改變成纖維細胞的分泌表型和信號通路的活化模式。該療法總體上刺激MAPK家族分子(ERK、P38