人胚胎永久造血干細(xì)胞生物學(xué)特性及其與AGM區(qū)、胎肝造血微環(huán)境關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胚胎期造血系統(tǒng)的發(fā)育可分為兩個(gè)階段：原始造血階段和永久造血階段。在胚胎首先出現(xiàn)的造血為原始造血(primitivehematopoiesis)，位于胚外卵黃囊中央血島，僅產(chǎn)生原始有核紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞，無(wú)法產(chǎn)生脾集落形成單位和長(zhǎng)期重建造血的造血干細(xì)胞(long-termrepopulatinghematopoieticstemcells，LTR-HSCs)；能產(chǎn)生LTR-HSC、為胚胎大部分時(shí)期的發(fā)育提供造血物質(zhì)、為生后造血系統(tǒng)提供HSC

2、s儲(chǔ)備池的永久造血稍后發(fā)生。原始造血發(fā)生于卵黃囊血島已被普遍認(rèn)可，但永久造血的起源部位尚存爭(zhēng)議。長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為永久造血也是起源于胚外卵黃囊，而近10年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明永久造血起源于胚內(nèi)的主動(dòng)脈旁胚臟壁(paraaorticsplanchnopleura，PAS)/主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephrosregion，AGMregion)。AGM區(qū)正成為國(guó)際上造血發(fā)生發(fā)育機(jī)制、造血分化機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。

3、 由于永久HSC在AGM區(qū)存留時(shí)間短、數(shù)目極為有限，加之胚體幼小、取材困難，有關(guān)研究還十分有限。MarcosMA等報(bào)道小鼠AGM區(qū)細(xì)胞表達(dá)c-kit，AA4.1，Mac-1和Sca-1，但未對(duì)這類細(xì)胞的造血活性進(jìn)一步研究。DelassusS等分離孕11天小鼠的AGM單個(gè)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)CD34+ckit+細(xì)胞具有多系造血形成能力；RT-PCR和基因分析發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)CD34+ckit+細(xì)胞表達(dá)紅系(β-globin)和髓系(MPO)標(biāo)

4、志，不表達(dá)淋巴系標(biāo)志CD3、Thy-1和λ5，多數(shù)細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因標(biāo)記如AML-1、PU.1、GATA2和Lmo2以及造血生長(zhǎng)因子受體G-CSF-R。人AGM區(qū)HSCs的表型迄今未有定論，也缺乏其基因表達(dá)的研究。 永久造血的發(fā)育受到兩方面因素的調(diào)控，即造血微環(huán)境及遺傳基因。AGM區(qū)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。 1.胎肝基質(zhì)細(xì)胞和胎肝MSC表面標(biāo)記的檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞抗原CD31、CD34、

5、CD45在二者表面為陰性表達(dá)，而CD29、CD44、CD105、CD106、CD166均為陽(yáng)性表達(dá)；與GVHD發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD40L均為陰性。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示人FL基質(zhì)細(xì)胞和MSC表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Fibronectin、α-SMA，同時(shí)表達(dá)發(fā)育中的FL細(xì)胞即上皮細(xì)胞的標(biāo)記AFP和E-cadherin。 2.造血相關(guān)基因和造血生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)

6、 FL基質(zhì)細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示人FL基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)造血相關(guān)基因GATA-2mRNA，表達(dá)gp130、BMP-4、TGF-β1mRNA，表達(dá)IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L、OSM、EPO等造血生長(zhǎng)因子mRNA，不表達(dá)TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。FL-MSC除不表達(dá)造血因子IL-3mRNA外，其他表達(dá)情況與基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況相同。 3.ELISA檢測(cè)胎肝基質(zhì)細(xì)胞和胎肝MSC培養(yǎng)上清中造血因子水平

7、 FL基質(zhì)細(xì)胞和MSC均分泌造血生長(zhǎng)因子BMP4、TGF-β1、EPO和IL-6，且因子水平高于胎齡35天YS來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞和軀干成纖維細(xì)胞(P＜0.05)。二者P5代細(xì)胞分泌因子的水平基本無(wú)顯著差異，而在P0、P10、P15代以基質(zhì)細(xì)胞分泌水平較高，其中各代FL基質(zhì)細(xì)胞EPO分泌水平始終高于FL-MSC。 4.小結(jié)本研究分離培養(yǎng)FL造血期FL基質(zhì)細(xì)胞和MSC。結(jié)果顯示，人FL基質(zhì)細(xì)胞和MSC表達(dá)造血微環(huán)境細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Fib

8、ronectin、α-SMA，同時(shí)表達(dá)發(fā)育中的胎肝細(xì)胞即上皮細(xì)胞的標(biāo)記AFP和E-cadherin，提示二者對(duì)胎肝造血期造血和肝臟發(fā)育具有重要意義。RT-PCR和ELISA檢測(cè)到胎肝基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種造血生長(zhǎng)因子，有作用于中胚層調(diào)節(jié)造血細(xì)胞形成的BMP4和TGF-β1，有作用于早期HSC和造血祖細(xì)胞的HGFs(IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L)，尚有作用于紅系的EPO表達(dá)。與FL-MSC相比，同一組織來(lái)源的胎肝基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更多的造