慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血造血干細(xì)胞生物學(xué)活性及其臨床應(yīng)用前期研究.pdf

1、干細(xì)胞因其具有自我更新及多向轉(zhuǎn)化的功能，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞替代治療、基因治療及組織工程。肝衰竭是威脅人類生命的嚴(yán)重疾病，并發(fā)癥多，病死率高，治療仍是世界難題。干細(xì)胞治療在肝衰竭領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多地受到人們的關(guān)注。
　　目的:研究慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血造血干細(xì)胞的生物學(xué)活性，及其促進(jìn)肝損傷修復(fù)、改善肝功能的可能機(jī)制;進(jìn)一步探討機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變對(duì)其功能的影響。
　　方法:本研究自慢加急性（亞急性）肝衰竭患者及健康志

2、愿者外周血分離CD34+細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，了解其生物學(xué)活性;通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子HGF、MMP-9、TNF-α、IL-6，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志丙酮酸激酶M2(PK-M2，未成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志)、整聯(lián)蛋白β1（Integrin-β1，肝細(xì)胞發(fā)育過程中細(xì)胞表面標(biāo)志），L型丙酮酸激酶同功酶（L-PK，成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志）的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志Integri

3、n-β1的表達(dá)，探究外周血CD34+細(xì)胞在肝病患者體內(nèi)修復(fù)損傷肝臟的可能機(jī)制;采用含慢加急性（亞急性）肝衰竭患者血漿置換前后血清的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)患者外周血CD34+細(xì)胞，通過比較兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志PK-M2、Integrin-β1，L-PK的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志Integrin-β1的表達(dá)情況，了解血漿置換后機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改善對(duì)外周血CD34+細(xì)胞生物學(xué)活性的影響;將熒光染料CFSE標(biāo)記的慢加急性

4、（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植入肝損傷小鼠體內(nèi)，通過觀察CFSE標(biāo)記的外周血單個(gè)核細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的遷移、在受損肝組織的定植，比較肝損傷干細(xì)胞治療組、肝損傷組及對(duì)照組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織病理改變，了解慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞歸巢及修復(fù)受損肝臟的能力。
　　結(jié)果:慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)顯示，其具有良好的生物性活性，細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡等特性較健康人外周血CD34

5、+細(xì)胞無明顯差異;慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細(xì)胞可分泌HGF、MMP-9、TNF-α、IL-6等可促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，細(xì)胞表面表達(dá)PK-M2和Integrin-β1，提示慢加急性（亞急性）肝衰竭時(shí)，外周血CD34+細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子、以及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能。含血漿置換后血清培養(yǎng)組外周血CD34+細(xì)胞的增殖明顯優(yōu)于含血漿置換前血清培養(yǎng)組(p＜0.05)，提示血漿置換有利于肝衰竭患者外周血

6、CD34+細(xì)胞的增殖;含血漿置換前血清培養(yǎng)組與含血漿置換后血清培養(yǎng)組均能檢測(cè)到PK-M2、Integrin-β1，未檢測(cè)到L-PK，提示血漿置換對(duì)于外周血造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的能力并無明顯影響。肝損傷小鼠尾靜脈注射熒光染料CFSE標(biāo)記的慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察肝組織冰凍切片，可見熒光標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞能夠遷移至受損肝組織，并定植于肝實(shí)質(zhì)內(nèi);觀察比較肝損傷干細(xì)胞治療組、肝損傷組及正常對(duì)照組小鼠不同時(shí)間

7、點(diǎn)的肝組織病理，可見肝損傷干細(xì)胞治療組小鼠干細(xì)胞移植后1周，肝損傷明顯改善，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織損傷逐漸修復(fù)，至第3周時(shí)已基本恢復(fù)正常。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細(xì)胞具有良好的生物學(xué)活性，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細(xì)胞還可通過旁分泌作用以及向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的途徑，促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能;血漿置換對(duì)肝衰竭患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改善有利于維持外周血CD34+細(xì)胞的生物學(xué)活性，