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文檔簡介
1、日本血吸蟲病嚴重影響著我國人民的身體健康以及制約著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展。日本血吸蟲病主要是血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染,成蟲在腸道定居、產(chǎn)卵并形成蟲卵肉芽腫導致肝、肺組織纖維化。腸系膜淋巴結為腸腔內主要的引流淋巴結,在受到外界抗原刺激后能誘導其內的淋巴細胞活化、增殖和分化,從而發(fā)揮一系列的免疫應答效應。Th17在血吸蟲感染誘導的免疫應答過程中發(fā)揮重要的作用。γδT細胞、NK細胞和NKT細胞都屬于天然免疫細胞,在多種感染性和腫瘤性疾病的早期反應中發(fā)
2、揮著重要的作用。本研究采用日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠動物模型,通過流式細胞術、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)等方法觀察腸系膜淋巴結Th17細胞和天然免疫細胞的含量和功能的變化情況。
研究目的:
觀察日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠所誘導的腸系膜淋巴結中Th17細胞和天然免疫細胞的特
3、征。
研究方法:
1.動物感染模型建立:將40只6~8周齡雌性SPF級C57BL/6小鼠隨機分成感染組和對照組(每組20只),感染組小鼠通過腹部貼片法感染(40±5條)日本血吸蟲尾蚴。
2.組織取材及制備單個細胞懸液:正常小鼠和感染小鼠,分別分離腸系膜淋巴結,研磨,通過200目篩網(wǎng)過濾,洗滌,制備成單個細胞懸液。
3.培養(yǎng)上清液中細胞因子檢測:調整淋巴細胞密度為2×106/ml,四種不同條件刺激7
4、2 h:①不刺激對照;②SEA(不同濃度)+anti-CD28(1μg/ml);③SWA(不同濃度)+anti-CD28(1μg/ml);④anti-CD3(1μg/ml)+anti-CD28(1μg/ml)。ELISA法檢測淋巴細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-17和IFN-γ的水平。
4.逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測IL-17和轉錄因子ROR-γt的mRNA水平:調整細胞密度為5×106/ml,在細胞懸液中加入或不加anti-CD3
5、(1μg/ml)和anti-CD28(1μg/ml)共同刺激4 h。提取淋巴細胞的總RNA,將總RNA進行逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA),以此為模板進行PCR擴增。
5.流式細胞學檢測:制備腸系膜淋巴結單個細胞懸液,經(jīng)不同條件刺激:①不刺激對照;②PMA(20 ng/ml)+Ionomycin(1μg/ml);③SEA(100μg/ml)+anti-CD28(1μg/ml);④SWA(100μg/ml)+anti-CD2
6、8(1μg/ml);⑤anti-CD3(1μg/ml)+anti-CD28(1μg/ml)。1 h后加入BFA(10μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4.5 h。經(jīng)固定、破膜和穿孔,加入相應熒光抗體染色,使用流式細胞儀檢測分析。
研究結果:
1. ELISA方法檢測結果表明感染小鼠腸系膜淋巴結的淋巴細胞經(jīng)anti-CD3+anti-CD28刺激72 h,細胞上清液中IL-17和IFN-γ水平含量明顯高于正常小鼠(P<0.05)。
7、
2. RT-PCR結果表明感染小鼠腸系膜淋巴結的淋巴細胞經(jīng) anti-CD3+anti-CD28刺激4 h,其中IL-17和轉錄因子ROR-γt的轉錄水平明顯高于正常小鼠(P<0.05)。
3.流式細胞檢測結果表明日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結中IL-17+CD4+T細胞含量明顯高于正常小鼠(P<0.05)。
4.流式細胞檢測結果表明日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結中CD4+T細胞的IL-17+IL-4+細
8、胞占0.06%, IL-17+IFN-γ+和IL-17+IL-5+細胞均占0.02%,IL-17+IL-9+細胞占0.01%。未檢測到IL-17+IL-10+和IL-17+foxp3+細胞。
5. ELISA結果表明SEA和SWA刺激日本血吸蟲感染小鼠腸系膜淋巴結的淋巴細胞產(chǎn)生的IL-17和IFN-γ明顯高于正常小鼠(P<0.05)。
6.流式細胞術檢測 SEA刺激感染小鼠腸系膜淋巴結 IL-17+CD4+T細胞和I
9、FN-γ+CD4+T細胞的含量分別為0.43%和0.56%,明顯高于正常組0.05%和0.20%(P<0.05);SWA刺激感染小鼠腸系膜淋巴結IL-17+CD4+T細胞和IFN-γ+CD4+T細胞的含量分別為0.39%和0.76%,明顯高于正常組0.04%和0.19%(P<0.05)。
7.感染小鼠腸系膜淋巴結γδT細胞的細胞絕對數(shù)為19.4±0.78×104,明顯高于正常組8.1±0.87×104(P<0.05);活化分子
10、CD69在感染小鼠的γδT細胞中的含量為29.83±1.2%,明顯高于正常小鼠6.35±0.63%(P<0.01)。
8.感染小鼠腸系膜淋巴結CD4+γδT細胞的含量為6.49±2.26%,明顯高于正常小鼠2.6±1.39%(P<0.05);感染小鼠腸系膜淋巴結CD8+γδT細胞、CD4+CD8+γδT細胞和CD4-CD8-γδT細胞與正常小鼠無明顯差異性(P>0.05)。
9.感染小鼠腸系膜淋巴結IL-4+γδT細
11、胞、IL-9+γδT細胞和IL-17+γδT細胞含量分別為6.51±0.72%、0.68±0.18%和10.75±1.56%,明顯高于正常小鼠3.4±1.52%、0.29±0.08%和4.31±1.14%(P<0.05)。
10.感染小鼠腸系膜淋巴結NK細胞的含量為5.8±1.4%,明顯高于正常小鼠2.8±0.77%(P<0.05);感染小鼠NK細胞的細胞數(shù)目為(1.47±0.25)×106,也明顯高于正常小鼠(0.29±0.
12、05)×106(P<0.01);感染小鼠腸系膜淋巴結NKT細胞的細胞數(shù)目分別為(0.28±0.02)×106,明顯高于正常小鼠(0.11±0.03)×106(P<0.01)。
11.活化分子CD69在感染小鼠NK細胞中的含量為44.71±2.0%,明顯高于正常小鼠28.7±4.25%(P<0.01);在感染小鼠NKT細胞中的含量為60.39±3.49%,明顯高于正常小鼠32.26±2.34%(P<0.01)。
12.
13、感染小鼠腸系膜淋巴結CD4+NK細胞的含量為1.83±0.18%,明顯高于正常小鼠0.81±0.25%(P<0.01);感染小鼠腸系膜淋巴結的CD8+NK細胞、CD4+CD8+NK細胞、CD4-CD8-NK細胞、CD8+NKT細胞、CD4+CD8+NKT細胞和CD4-CD8-NKT細胞的含量與正常小鼠無明顯差異性(P>0.05)。
13.感染小鼠腸系膜淋巴結 IL-4+NK細胞和IL-17+NK細胞分別為3.33±0.16%和
14、2.93±0.44%,明顯高于正常小鼠2.12±0.18%和1.56±0.41%(P<0.05);感染小鼠腸系膜淋巴結 IL-4+NKT細胞、IL-9+NKT細胞和IL-17+NKT細胞分別為2.17±0.90%、0.9±0.36%和3.23±1.12%,明顯高于正常小鼠1.13±0.2%、0.2±0.06%和1.08±0.08%(P<0.05)。
14.抑制性受體NKG2A/C/E和活化性受體NKG2D在感染小鼠腸系膜淋巴結
15、的NK細胞中的含量為30.76±1.35%和46.07±6.06%,與正常小鼠55.51±4.55%和60.31±6.18%相比明顯降低(P<0.05);抑制性受體NKG2A/C/E在感染小鼠和正常小鼠腸系膜淋巴結的NKT細胞中的含量為46.07±4.37%和47.45±2.78%,結果無顯著性差異(P>0.05);活化性受體NKG2D在感染小鼠腸系膜淋巴結的NKT細胞中的含量為47.03±5.07%,與正常小鼠63.17±5.06%相
16、比較明顯降低(P<0.05)。
結論:
1.日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠能誘導腸系膜淋巴結Th17細胞的產(chǎn)生;Th17細胞能分泌IL-4,可以少量分泌IFN-γ、IL-5和IL-9,不分泌IL-10,也不表達Foxp3。
2.日本血吸蟲感染 C57BL/6小鼠腸系膜淋巴結存在 SEA和SWA特異性Th17細胞。
3.日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠能誘導腸系膜淋巴結γδT細胞活化、增殖和分化。
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