BCG對感染嚙齒類瘧原蟲C57BL-6小鼠免疫應(yīng)答的影響及其機制研究.pdf

1、瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的一種對人類健康危害極為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。2010年WHO瘧疾報告顯示全球約33億人口受到瘧疾威脅。在瘧疾流行區(qū)，瘧原蟲與結(jié)核、艾滋病、蠕蟲等其他病原體共同感染現(xiàn)象十分常見并普遍存在。瘧原蟲與發(fā)病率第一位的結(jié)核共同感染是近年來凸顯的公共衛(wèi)生問題。然而，關(guān)于結(jié)核對瘧疾感染進程和結(jié)局的影響及其相關(guān)機制尚不明確。因此，探討瘧疾流行區(qū)病原體之間的相互作用特點，特別是對瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)機制，不僅可進

2、一步充實對瘧疾免疫的認識，而且無疑將為揭示瘧疾流行區(qū)病原體相互作用的細胞和分子機制提供新的理論依據(jù)。
　　 血清流行病學(xué)研究已經(jīng)揭示流行區(qū)瘧疾發(fā)生的一些鮮明特征，嚴重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腦瘧等免疫病理損傷是5歲以下兒童死亡的主要原因，然而，反復(fù)暴露于瘧原蟲感染的個體可逐步建立低原蟲血癥水平的帶蟲免疫。調(diào)控保護性與病理性免疫平衡無疑是瘧疾防控的關(guān)鍵。嚙齒類瘧原蟲感染小鼠為深入探討抗人瘧保護性免疫應(yīng)答機制，提供了一種寶貴的實驗動物模型。嚙齒

3、類動物模型的研究數(shù)據(jù)顯示，不同小鼠在感染同種瘧原蟲時，會出現(xiàn)死亡和自愈兩種截然不同的結(jié)局。同一小鼠感染不同瘧原蟲時，會出現(xiàn)免疫保護或免疫病理兩種不同的免疫應(yīng)答模式。C57BL/6小鼠感染夏氏瘧原蟲后可以自愈，但感染伯氏瘧原蟲后可誘導(dǎo)致死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病(通常稱為實驗性腦型瘧疾)。在瘧原蟲感染早期，以IFN-γ分泌增加為主的Th1型細胞免疫應(yīng)答遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖。隨之，由Th2型細胞輔助B細胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效地清除瘧原蟲，防止復(fù)

4、發(fā)和再燃。過度的Th1免疫應(yīng)答及前炎癥細胞因子分泌會造成病理損傷或引起宿主死亡。由此表明：抗瘧保護性免疫依賴于Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡。
　　 作為活化初始T細胞的專職抗原提呈細胞(antigen present cell，APC)，樹突狀細胞(dendritic cell，DC)在固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答協(xié)調(diào)建立過程中起到了關(guān)鍵的橋梁作用。前期的實驗證明，致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17X

5、L，P.y17XL)感染BALB/c小鼠和DBA/2小鼠，DC的分化模式及成熟表型的特征分子在表達水平上均存在顯著的差異。與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，紅內(nèi)期瘧原蟲誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的抗感染免疫效應(yīng)可對其施加控制。嚙齒類動物模型和人類研究的數(shù)據(jù)顯示，Treg在瘧原蟲感染過程中出現(xiàn)明顯活化與增殖。Treg可調(diào)控瘧疾急性期前炎癥應(yīng)答和/或Th1記憶反應(yīng)，Treg通過與免疫細胞直接接觸和產(chǎn)生調(diào)控性細胞因子IL-10和TGF-β抑制細胞免疫應(yīng)答。我們前

6、期的研究結(jié)果也證實，P.y17XL感染早期，BALB/c小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的高水平IL-10是抑制Th1細胞免疫應(yīng)答效應(yīng)強度的關(guān)鍵因素。
　　 瘧疾與其他病原體共同感染在瘧疾流行區(qū)較為常見，其中有的病原體共同感染可提高宿主抗瘧免疫的保護效應(yīng)并能抑制瘧疾的發(fā)生。研究顯示，TB感染可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生CD4+Th1應(yīng)答，消除IFN-γ的小鼠感染TB加速小鼠死亡。BCG是TB減毒活疫苗，能夠啟動以分泌IFN-γ為主的Th1細胞免疫反應(yīng)

7、，并進一步活化巨噬細胞吞噬TB。BCG預(yù)先免疫小鼠感染P.y17XL后，可迅速建立以IFN-γ升高為主的Th1應(yīng)答，同時蟲體血癥水平也顯著低于未接種BCG的對照鼠，并具較高生存率；BCG免疫的C57BL/6小鼠對P.c chabaudi AS感染呈現(xiàn)顯著的易感性。此外，BCG預(yù)先免疫的Wistar大鼠也可抑制紅外期瘧原蟲的發(fā)育。然而瘧疾感染發(fā)生后，免疫接種BCG是否能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生有效的免疫保護，尤其是能否降低CM的發(fā)生風(fēng)險目前尚不清楚。

8、有關(guān)于BCG對瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)機制尚需進一步明確。
　　 本研究利用可誘導(dǎo)免疫保護或免疫病理兩種不同感染結(jié)局的瘧原蟲與不同時相BCG共同感染鼠瘧模型，動態(tài)觀察BCG對小鼠感染進程與感染結(jié)局的影響。特別是通過對比分析宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答特點，旨在進一步揭示瘧原蟲與BCG共同感染的相關(guān)細胞和分子機制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確立提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1、實驗動物及模型構(gòu)建

9、r>　　 (1)6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔感染分別感染1×106P.c chabaudi AS與P.6 ANKA寄生紅細胞。
　　 (2)感染P.c chabaudi的C57BL/6小鼠分別于感染前4w、0d及感染后第3d尾靜脈給予BCG。每只鼠0.05mg。
　　 (3)感染.P.b ANKA的C57BL/6小鼠分別于感染前3d、0d及感染后第3d尾靜脈給予BCG。每只鼠0.05mg。
　　 2

10、、脾細胞熒光抗體染色
　　 無菌取出感染前(第0d)和感染后第3d、5d、8d、12d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體進行三色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體

11、的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體和抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體進行表面染色。離心去上清后，用0.5ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗-MHCⅡ-PE單克隆抗體、或抗-CD80-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染

12、色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-MHCⅡ-PE單克隆抗體和抗-CD80-PE單克隆抗體。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。每份樣品用抗-CD4-FITC單克隆抗體和抗-CD69-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，再加入抗-CD4-FITC單克隆抗體和抗-CD69-

13、PE單克隆抗體。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。每份樣品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進行胞內(nèi)染色，用含1% FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5 ml PBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　 3、IFN-γ、TNF-α，和IL-10定量檢測
　　 用ELISA試劑盒分別檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL

14、-10的分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進行，結(jié)果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P<0.05為顯著差異。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小

15、鼠的原蟲血癥水平和生存率
　　 P.c chabaudi AS感染后第5d，小鼠的外周血中可見瘧原蟲感染的紅細胞，隨后感染率迅速升高。于感染后第9～10d，紅細胞感染率達到峰值(15.4%)，而后開始逐漸下降，小鼠于感染后第22d自愈。P.c+B、P.c-3-B組小鼠的感染模式與P.c chabaudi AS單獨感染(P.c組)基本一致。然而，B-4w-P.c組小鼠于感染后第6～19d紅細胞感染率顯著升高，于感染后第11d達到峰

16、值(44.3%)，并于感染后第15～20d全部死亡。
　　 P.b ANKA感染后第3d，小鼠的外周血中可見瘧原蟲感染的紅細胞，隨后紅細胞感染率緩慢上升并維持在較低水平(<10%)，于8～10d全部死于CM。B-3-P.b、P.b+B組小鼠感染模式和P.b ANKA單獨感染基本一致，小鼠在感染后第8～10d全部死于CM。然而，P.b-3-B組小鼠于感染后第5～7d紅細胞感染率顯著低于P.bANKA單獨感染小鼠，并于第9d開始顯著

17、升高，66.7%的小鼠生存期延長，于感染后第20d死于貧血。
　　 2、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾DC亞群百分率
　　 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS單獨感染小鼠脾細胞中mDC和pDC數(shù)量均出現(xiàn)明顯增加，P.c+B、P.c-3-B組小鼠與P.c chabaudi AS單獨感染小鼠在DC亞群數(shù)量上無顯著差異。然而，B-4w-P.c組小鼠mDC和pDC數(shù)量均顯著低于P.c chab

18、audi AS單獨感染組。
　　 與感染前相比，P.b ANKA單獨感染小鼠脾細胞中mDC和pDC數(shù)量于感染后第5d、8d出現(xiàn)有意義增加，B-3-P.b、P.b+B組小鼠與P.b ANKA單獨感染小鼠在DC亞群數(shù)量上無顯著差異。然而，P.b-3-B組小鼠感染后第5d和8d mDC的數(shù)量以及感染后第8d pDC數(shù)量均顯著低于P.b ANKA單獨感染組小鼠。
　　 3、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾DC表面分子CD80

19、和MHCⅡ表達水平
　　 與感染前相比，P.c chabaudi AS單獨感染組于感染后第8d，DC表面分子CD80表達水平出現(xiàn)明顯增加，P.c+B、P.c-3-B組小鼠與P.c chabaudi AS單獨感染小鼠CD80分子的表達無顯著差異，但B-4w-P.c組小鼠CD80表達水平顯著低于P.cchabaudi AS單獨感染組。
　　 于感染后第5d、8d，P.b ANKA單獨感染小鼠DC表面分子CD80表達水平明顯增

20、加，B-3-P.b、P.b+B組小鼠與P.b ANKA單獨感染小鼠CD80分子的表達無顯著差異。而感染后第8d，P.b-3-B組小鼠CD80的表達顯著低于P.b ANKA單獨感染組。
　　 與感染前相比，P.c chabaudi AS單獨感染后第8d，DC表面MHCⅡ分子表達水平明顯增加，P.c+B、P.c-3-B組小鼠與P.c chabaudi AS單獨感染小鼠MHCⅡ分子表達無顯著差異，但B-4w-P.c組小鼠DC表面MHC

21、Ⅱ分子的表達顯著低于P.cchabaudi AS單獨感染組。
　　 感染后第5d、8d，P.b ANKA單獨感染組DC表面MHCⅡ分子表達水平明顯增加，B-3-P.b、P.b+B組小鼠與P.b ANKA單獨感染小鼠MHCⅡ分子的表達無顯著差異。然而，P.b-3-B組小鼠DC表面MHCⅡ分子的表達顯著低于P.b ANKA單獨感染組。
　　 4、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾CD4+CD69+T細胞百分率
　　

22、 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS單獨感染小鼠CD4+CD69+T細胞均出現(xiàn)明顯增加，P.c+B、P.c-3-B組小鼠與其上無統(tǒng)計學(xué)差異。然而，B-4w-P.c組小鼠CD4+CD69+T細胞數(shù)量顯著低于P.c chabaudi AS單獨感染小鼠。
　　 于感染后第5d、8d，P.b ANKA單獨感染小鼠CD4+CD69+T細胞都出現(xiàn)明顯增加，B-3-P.b和P.b+B組小鼠與其無統(tǒng)計學(xué)差異，而P.

23、b-3-B組小鼠CD4+CD69+T細胞的數(shù)量顯著低于P.b ANKA單獨感染小鼠。
　　 5、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg百分率
　　 與感染前相比，感染后第5d和12d，P.c chabaudi AS感染小鼠Treg細胞出現(xiàn)明顯升高，P.c+B、P.c-3-B組小鼠與其無統(tǒng)計學(xué)差異。然而，在感染后第5d、8d，B-4w-P.c組小鼠Treg細胞數(shù)量顯著高于于P.c cha

24、baudi AS單獨感染小鼠，在感染后第12d，則Treg明顯低于P.c chabaudi AS單獨感染小鼠。
　　 與感染前相比，感染后第8d，P.6 ANKA單獨感染小鼠Treg出現(xiàn)明顯升高，B-3-P.b和P.b+B組小鼠與其無統(tǒng)計學(xué)差異。然而，P.b-3-B組小鼠Treg的數(shù)量在感染后5d、8d，均顯著高于P.b ANKA單獨感染小鼠。
　　 6、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量

25、
　　 與感染前相比，感染后第5d、8d和12d，P.c chabaudi AS單獨感染小鼠脾細胞IFN-γ分泌出現(xiàn)明顯增加，P.c+B和P.c-3-B組小鼠與其無顯著差異。反之，B-4w-P.c組小鼠IFN-γ水平顯著低于P c chabaudi AS單獨感染小鼠。
　　 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.b ANKA單獨感染小鼠脾細胞IFN-γ分泌出現(xiàn)明顯增加，B-3-P.b和P.b+B組小鼠與其無統(tǒng)計學(xué)差異。P

26、.b-3-B組小鼠IFN-γ含量顯著低于P.b ANKA單獨感染小鼠。
　　 7、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量
　　 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS單獨感染小鼠脾細胞TNF-α分泌出現(xiàn)明顯增加，P.c+B和P.c-3-B組小鼠與其無顯著差異。然而，B-4w-P.c組小鼠TNF-α的含量顯著低于P.c chabaudi AS單獨感染小鼠。
　　

27、 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.b ANKA單獨感染小鼠脾細胞TNF-α分泌出現(xiàn)明顯增加，B-3-P.b和P.b+B組小鼠與其無統(tǒng)計學(xué)差異。P.b-3-B組小鼠在感染后第5d，TNF-α的含量顯著低于P.b ANKA單獨感染小鼠。
　　 8、BCG分別與兩種瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-10的含量
　　 與感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS單獨感染小鼠脾細胞IL-10分泌出現(xiàn)

28、明顯增加，而在感染后第12d，IL-10分泌顯著降低，P.c+B和P.c-3-B組小鼠與其無顯著差異。然而，B-4w-P.c組小鼠IL-10的含量在感染后第5d、8d，顯著低于P.c chabaudi AS單獨感染小鼠，而在感染后第12d，IL-10分泌顯著高于P.cchabaudi AS單獨感染小鼠。
　　 與感染前相比，感染后第5d，P.b ANKA單獨感染小鼠脾細胞IL-10分泌水平出現(xiàn)顯著增加，感染后第8d，其分泌水平顯

29、著降低。P.b+B和B-3-P.b組小鼠與其無明顯差異，而P.b-3-B組小鼠IL-10分泌水平顯著高于P.b ANKA單獨感染小鼠。
　　 結(jié)論：
　　 1.BCG與P.c chabaudi AS同時感染或P.c chabaudi AS感染3天后再感染BCG小鼠的感染過程和結(jié)局與單獨感染P.c chabaudi AS小鼠基本一致，而BCG感染4周后再感染P.c chabaudi AS則顯著提高小鼠原蟲血癥水平而導(dǎo)致小鼠

30、死亡。
　　 2.BCG與P.b ANKA同時感染或BCG感染3天后再感染P.b ANKA小鼠的感染過程和結(jié)局與單獨感染P.b ANKA小鼠基本一致，而P.b ANKA感染3天后再感染BCG小鼠生存期顯著延長，且無CM發(fā)生。
　　 3.BCG與P.c chabaudi AS同時感染或P.c chabaudi AS感染3天后再感染BCG小鼠的DC亞群數(shù)量、分化與單獨感染P.c chabaudi AS小鼠無明顯差異。而BCG

31、感染4周后再感染P.c chabaudi AS可降低小鼠DC亞群數(shù)量同時降低小鼠DC表面CD80和MHCⅡ分子表達水平，抑制DC的增殖分化和成熟。
　　 4.BCG與P.b ANKA同時感染或BCG感染3天后再感染P.b ANKA小鼠的DC亞群數(shù)量、分化與單獨感染P.b ANKA小鼠無明顯差異。然而，P.b ANKA感染3天后再感染BCG可降低小鼠DC亞群數(shù)量同時降低小鼠DC表面CD80和MHCⅡ分子表達水平，抑制DC的增殖分化