“輕型腦炎”患者標本中病毒的分離與初步分析.pdf

1、病毒性腦炎(簡稱病腦)是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病?，F(xiàn)已知多數(shù)病毒幾乎均可引起病腦。全世界報道的病毒性腦炎正呈現(xiàn)新的流行趨勢。近年由于疫苗的改進與普遍接種及傳染媒介控制措施得力，具有季節(jié)性、流行性的乙腦、森林腦炎及各種小兒傳染病發(fā)病率急劇下降，因而腸道病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒等已成為小兒病毒性腦炎的常見病原。而近年發(fā)生或再現(xiàn)的病毒有：牛海綿樣腦病(瘋牛病)病原(朊病毒)，禽流感H5N1型，尼帕病毒，西尼羅病毒，傳染性非典型肺炎病

2、毒(SARS)，人類皰疹病毒6型(HHV6)，腸道病毒71型(EV71)等。 2003年、2004年夏季七月至秋季，在我國全國各地廣泛流行“輕型腦炎”，患者多為兒童，7～8月份為發(fā)病高峰，8月中旬以后就診人數(shù)驟減乃至消失。主要癥狀為：發(fā)熱(38-41)℃，有顱內(nèi)高壓癥狀如噴射性嘔吐等，無抽風，所有患者無死亡，無明顯后遺癥。與乙腦、散發(fā)性腦炎等以往常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染有顯著不同。輔助檢查：血常規(guī)白細胞計數(shù)正常；腦脊液常規(guī)：外觀

3、清晰透明，有核細胞計數(shù)正常或略高，腦脊液細胞學(xué)分類以淋巴細胞為主，腦電圖及CT等表現(xiàn)以及抗病毒藥物(更昔洛韋)治療有效，提示病毒感染。從患者病史、臨床表現(xiàn)等各方面綜合分析可能以呼吸道傳播為主。從病人的臨床癥狀和流行特點來看，與常見的病毒性腦炎不同。2003年該研究室曾對該時段發(fā)生的腦炎進行過病毒分離，電鏡形態(tài)學(xué)觀察為(120-270)nm顆粒、有包膜呈螺旋對稱結(jié)構(gòu)，PCR得到的電泳條帶未能得到與病毒有關(guān)的序列。這種病原體到底是一種新病毒

4、，還是一種常見病毒的異位感染?其研究結(jié)果都將對于研究病毒的變異規(guī)律、流行病學(xué)特征、一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)特點、檢測及臨床治療、預(yù)防新發(fā)“輕型腦炎”具有重要的意義。 目的： 從“輕型腦炎”患者腦脊液標本中分離病毒，探討分離到的病毒與常見病毒性腦炎病原學(xué)的生物學(xué)關(guān)系。 方法： 從“輕型腦炎”患者中采集腦脊液。對標本進行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變的標本連續(xù)傳代，觀察感染細胞的病變特性，電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，根據(jù)細胞生

5、物學(xué)特性、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果分析和縮小病毒種屬研究范圍，用黃病毒屬單克隆抗體-ELISA方法檢測與乙型腦炎病毒的關(guān)系，用血球凝集試驗探討病毒是否有凝集素，采用副粘病毒科病毒和腸道病毒屬、甲病毒屬、黃病毒屬的各自通用引物，進行RT-PCR檢測，通過以上實驗對新發(fā)“輕型腦炎”進行病原學(xué)分析。 1.標本來源：濟南市兒童醫(yī)院的病人腦脊液42份，發(fā)病年齡為(3-8)歲，主要來自郊區(qū)和附近農(nóng)村。 2.病毒分離：將腦脊液濾菌后接種于單層H

6、ep-2細胞上，加維持液，37℃、5％C02溫箱培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，并拍照記錄。 3.分離病毒的電鏡觀察：收集病毒細胞培養(yǎng)物，分別做沉淀、差速離心和超速離心，滴網(wǎng)，用1％磷鎢酸負染色后做透射電鏡觀察。 4.病毒培養(yǎng)物的毒力滴定：將次代培養(yǎng)物做10倍比稀釋后依次接種于96孔板孔內(nèi)已長成單層的Hep-2細胞上，于37℃、5％℃O2溫箱培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，用中性紅染色，用分光光度計在540nm波長測定OD值，按Reed

7、-Muench法計算病毒TCID50。 5.血球凝集試驗：將病毒培養(yǎng)液做倍比稀釋后，與等量5％雄雞紅血球混合，室溫靜止45min后觀察血球凝集現(xiàn)象。 6：黃病毒屬單克隆抗體ELISA檢測病毒抗原(交叉連續(xù)稀釋法)：將病毒培養(yǎng)物以1：20、40、80、160橫向包被酶標板，同時縱向重復(fù)4孔，將單抗以1：10-2、10-3、10-410-510-610-7分別加入不同濃度包被的酶標板中，同時設(shè)計有其他病毒對照，顯色后用酶標儀

8、檢測A450值，P/N≥2.1判斷陽性。 7.RT-PCR檢測：從資料獲取腸道病毒屬、甲病毒屬、黃病毒屬的各自通用引物(共三對)，根據(jù)Genebank查得副粘病毒科F基因的核酸序列，利用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5，設(shè)計合成四對引物進行RT-PCR，從而確定病毒的屬種。 1)提取總RNA：病毒增殖物沉渣100μl，加GIT變性液、NaAC、水飽和酚、氯仿、異丙醇，提取RNA。 2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在上述標

9、本中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、下游引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。 3)PCR擴增：在模板cDNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶，經(jīng)過變性(denaturation)、退火(annealling)、延伸(extention)共35個循環(huán)，獲取cDNA的擴增產(chǎn)物。 4)電泳鑒定：用Mark作標記，鑒定目的cDNA的存在，利用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(KodakDigitalscience1D)進行圖像

10、分析。 結(jié)果： 1.病原學(xué)分離：標本接種于Hep-2細胞(3-5)天后，與正常細胞對照組比較，病變細胞出現(xiàn)腫脹、變圓、脫落現(xiàn)象。 2.電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有病毒樣顆粒、空殼顆粒直徑在(80-120)nm之間，規(guī)則、圓形，有包膜，核心為螺旋對稱結(jié)構(gòu)。 3.血球凝集試驗：分離到的4株病毒培養(yǎng)物均未發(fā)生血球凝集現(xiàn)象。 4.黃病毒屬單克隆抗體ELISA檢測：各病毒稀釋度和單抗稀釋度之OD值的P/N值均未出現(xiàn)≥2.

11、1現(xiàn)象。 5.RT-PCR：用副粘病毒科引物進行的擴增、凝膠電泳，劉蕾蕾和無標記號標本得到不典型的條帶；用其他引物擴增未得到目的條帶。其他標本任何引物均無條帶產(chǎn)生。 結(jié)論： 新分離的病毒與常見引起腦炎的病毒株在電鏡形態(tài)學(xué)上有顯著差異，生物屬性與DNA病毒、腸道病毒屬、黃病毒屬、甲病毒屬無關(guān)，與含有血凝素者病毒無關(guān)(血球凝集試驗陰性)，與呼吸道合胞病毒無關(guān)(PCR陰性)；PCR出現(xiàn)不典型條帶結(jié)果提示不能完全排除副粘