日本腦炎病毒受體候選分子的初步研究.pdf

1、日本腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是有囊膜的正鏈RNA病毒，主要的囊膜糖蛋白E與病毒的神經(jīng)毒性和神經(jīng)侵襲性相關(guān)，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。作為JEV的病毒吸附蛋白（virusattachmentprotein，VAP），E蛋白介導(dǎo)JEV與宿主細胞受體結(jié)合及膜融合。JEV在鳥與蚊子之間有一個區(qū)域性傳播循環(huán)，豬作為中間擴增宿主，帶毒蚊子通過叮咬將感染性病毒傳播給人。JEV引

2、起的流行性乙型腦炎（乙腦），是一種嚴重的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要流行于我國廣大地區(qū)及東亞、東南亞和南亞。
　　JEV致病機制尚未完全闡明。人被攜帶JEV的蚊子叮咬后，病毒先在淋巴細胞、骨髓細胞及血管內(nèi)皮細胞增殖。在侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)前，有一個短暫的病毒血癥期。JEV和腦血管內(nèi)皮細胞及其周圍細胞的細胞膜相互作用后，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，JEV與胞漿囊泡膜融合形成內(nèi)化囊泡，再被轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障。在顱內(nèi)，JEV僅在神經(jīng)元中復(fù)制。神經(jīng)元和

3、膠質(zhì)細胞大量表達巨噬細胞移動抑制因子（MIF），介導(dǎo)廣譜的免疫炎癥反應(yīng)。JEV的感染也誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡。
　　目的：
　　病毒與細胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制過程中的始動環(huán)節(jié)，也是影響病毒宿主特異性、組織親嗜性和致病性的決定因素之一。目前，JEV在易感細胞上的受體分子及其特性與功能仍然不清楚。為了鑒定JEV的受體，本研究從以下兩種思路出發(fā)，分別進行了JEV受體候選分子的初步研究。
　　方法和結(jié)果：
　　一、

4、篩選建立JEV受體功能缺陷的細胞系，并鑒定其功能。
　　應(yīng)用ICR-191（一種DNA烷化劑，通過DNA小片段缺失和移碼突變使細胞隨機突變）誘變JEV易感細胞——地鼠腎細胞BHK-21。經(jīng)過JEV攻擊、克隆化和RT-PCR篩選，獲得了一株突變細胞系3A10-3F，并鑒定其為JEV受體功能缺陷。
　　1.間接免疫熒光實驗：JEV感染的3A10-3F細胞的熒光強度明顯弱于JEV感染的BHK-21細胞，說明3A10-3F細胞對JE

5、V的感染有相當?shù)牡挚埂?br>　　2.空斑實驗：MOI1和MOI10的JEV感染后，3A10-3F細胞比BHK細胞上清中JEV最高滴度分別降低了2個數(shù)量級和1個數(shù)量級，進一步證實3A10-3F細胞的確對JEV的敏感性降低了許多。
　　3.流式細胞術(shù)：3A10-3F細胞與JEV的結(jié)合率僅有2.10％,而BHK-21細胞與JEV的結(jié)合率可達48.84％。3A10-3F細胞對JEV的結(jié)合率明顯降低，進一步說明3A10-3F細胞為JEV受

6、體功能缺陷。
　　4.對單純皰疹病毒1型（HSV-1）的易感性：在形態(tài)上，3A10-3F細胞與BHK-21細胞相似，仍然保留著對HSV-1的易感性。HSV-1感染后，與BHK-21一樣出現(xiàn)細胞病變：細胞融合，變圓及融合。所以這株突變細胞系對JEV感染的抵抗是特異的。
　　5.為了鑒定突變細胞3A10-3F與親代細胞BHK-21膜分子的表達差異，應(yīng)用了蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，即二維電泳（2-DE）組合液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS/MS）

7、技術(shù)，首次鑒定了3A10-3F細胞上有明顯差異表達的四種膜蛋白，即鈣結(jié)合蛋白annexin1,annexin2；電壓依賴的離子通道（VDAC）蛋白VDAC1,VDAC2。
　　6.3A10-3F細胞上annexin1,annexin2的表達明顯下降。這兩個分子有可能通過與脂膜的相互作用與JEV的結(jié)合相關(guān)，它們在3A10-3F細胞上表達的下調(diào)，導(dǎo)致JEV與3A10-3F細胞膜的結(jié)合能力明顯下降。
　　7.VDAC1僅僅表達在3

8、A10-3F細胞上，VDAC2在3A10-3F細胞上的表達升高。這兩個VDAC分子可能在JEV穿入3A10-3F細胞過程中起著離子通道的作用，同時也參與其它包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞功能。
　　二、從易感細胞上分離JEV受體候選分子，并初步鑒定其功能。
　　1.應(yīng)用免疫共沉淀方法（Co-immunoprecipitation,Co-IP），從白紋伊蚊細胞C6/36、非洲綠猴腎細胞Vero及BHK-21細胞膜上，分離到多個與JEV結(jié)合

9、的分子條帶。
　　2.質(zhì)譜分析首次鑒定出一個蛋白，即C6/36細胞上與JEV結(jié)合的74kD分子為HSC70蛋白。
　　3.免疫印記實驗中，用抗HSC70抗體檢測到從C6/36細胞膜上免疫共沉淀分離到的74kD蛋白。
　　4.將主要的JEV受體候選分子，即C6/36細胞膜上免疫共沉淀分離到的74kD、97kD分子電洗脫下來后，分別免疫小鼠制備抗體，進行病毒結(jié)合的阻斷實驗。結(jié)果顯示，抗74kD、97kD抗體及抗HSC70抗

10、體均以劑量依賴的方式部分阻斷JEV與C6/36細胞的結(jié)合。在JEVMOI100，抗體濃度為200μg時，抗97kD、74kD抗體和抗HSC70抗體分別使JEV的結(jié)合率下降38％、35％、20％。
　　5.間接免疫熒光實驗：激光共聚焦顯微鏡觀察到74kD、97kD及HSC70分子定位在C6/36細胞膜上。免疫熒光雙標記實驗結(jié)果顯示JEV與74kD、97kD及HSC70分子共定位在C6/36細胞膜上。這些結(jié)果說明74kD、97kD及H