酪氨酸酶異源表達(dá)體系構(gòu)建及活性分析.pdf

1、酪氨酸酶是一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的氧化還原酶類(lèi)，能夠催化酪氨酸生成黑色素，普遍存在于微生物、植物以及哺乳動(dòng)物中。酪氨酸酶具有多種特殊的催化活性，近年來(lái)在食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，引起了國(guó)內(nèi)外的普遍關(guān)注。但由于從生物體內(nèi)直接分離純化酪氨酸酶工藝非常復(fù)雜，產(chǎn)量十分有限，導(dǎo)致目前商品化的酪氨酸酶價(jià)格昂貴且需國(guó)外進(jìn)口，嚴(yán)重制約了酪氨酸酶的生產(chǎn)應(yīng)用。因而利用分子重組技術(shù)獲得高效表達(dá)酪氨酸酶的工程菌成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。 釀酒酵母(Saccharomyc

2、es cerevisiae）作為真核模式生物，以其生長(zhǎng)繁殖快，蛋白質(zhì)含量高和安全無(wú)毒等特點(diǎn)，目前已成為異源表達(dá)的首選菌種。
　　本文借助化學(xué)合成和反轉(zhuǎn)錄方法，分別獲得了根瘤菌（Rhizobium etli），麥芽假單胞菌（Pseudomonas maltophila）以及雙胞蘑菇（Agaricus bisporus）的酪氨酸酶相關(guān)基因，并以釀酒酵母S288C衍生體BY系列菌株作為出發(fā)菌株，構(gòu)建了酪氨酸酶的異源表達(dá)體系。通過(guò)檢測(cè)酪氨

3、酸酶的異源表達(dá)情況，成功篩選到一株能夠正確表達(dá)雙胞蘑菇酪氨酸酶的釀酒酵母菌株 SC-PPO2A，為酪氨酸酶的商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了可能。隨后通過(guò)在離體條件下對(duì)酪氨酸酶活性的分析測(cè)定，探索了各種催化條件對(duì)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶體外催化最適 pH為7.0-8.0，最適溫度45℃，對(duì)底物酪氨酸和L-DOPA的飽和濃度分別為2mM和15mM。繼而通過(guò)對(duì)酪氨酸酶的胞內(nèi)活性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，將穩(wěn)定期的酵母培養(yǎng)體系pH調(diào)至9.0，同時(shí)補(bǔ)加2.5mg/m