博萊霉素與肺炎雙球菌致大鼠肺損傷過(guò)程中TGF-β-,1-和VEGF表達(dá)的比較研究.pdf

1、本研究為探討博萊霉素致肺損傷后肺纖維化形成的機(jī)理、并尋找其可能的治療策略，用免疫組織化學(xué)和電鏡觀(guān)察方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)了博萊霉素與肺炎雙球菌致大鼠肺損傷過(guò)程中TGF-β1和VEGF表達(dá)的差異以及青霉素的干預(yù)作用，以期闡明PF形成的分子機(jī)制、從而為制定PF早期診治的策略提供新的思路。 研究方法：以健康SD雄性大鼠150只(由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重180～210g，隨機(jī)分為5組(BLM組、BLM+P組、PMDC組、PMDC+P組及對(duì)照

2、組)，每組各30只。 BLM與PMDC致大鼠肺損傷和肺炎模型的制作：用10mg.ml-1戊巴比妥鈉0.5ml腹腔麻醉大鼠，手術(shù)暴露氣管，用1ml注射器抽取含博萊霉素-A5(5mg.kg-1，用生理鹽水配成4g.L-1溶液)溶液，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，將藥液注入氣管；PMDC組同法經(jīng)氣管穿刺后每只大鼠注入肺炎雙球菌液0.2ml(CFU3×108/ml)。BLM+P組和PMDC+P組大鼠在進(jìn)行上述處理后第3d開(kāi)始給予青霉

3、素(40萬(wàn)U/只/d)治療，連續(xù)給藥4d至第7d結(jié)束。對(duì)照組在相同條件下氣管內(nèi)注入相同數(shù)量的生理鹽水，方法同BLM模型組。PMDC組動(dòng)物分別于3和7d隨機(jī)處死6只、14和28d各處死9只，其余四組動(dòng)物分別于7、14和28d各隨機(jī)處死10只。取左全肺，分別行肺組織標(biāo)本HE染色和透射電鏡、TGF-β1及VEGF免疫組織化學(xué)染色；用圖像分析系統(tǒng)對(duì)其肺組織中VEGF和TGF-β1進(jìn)行定性、定量分析。 研究結(jié)果： 1、病理組織學(xué)觀(guān)

4、察：對(duì)照組肺泡及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。肺炎雙球菌(PMDC)組3d時(shí)可見(jiàn)肺泡壁水腫，肺泡腔內(nèi)出血明顯，肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞增多，并出現(xiàn)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。7d時(shí)PMDC組出現(xiàn)典型的細(xì)菌性肺炎癥狀，表現(xiàn)為肺泡和間質(zhì)的滲出增多，部分區(qū)域出現(xiàn)實(shí)變；14d時(shí)上述癥狀有所減輕，28d時(shí)除仍有少量實(shí)變區(qū)外，大部分肺組織恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。PMDC+P組在第7d時(shí)肺泡炎的癥狀即明顯減輕，至第14和28天時(shí)基本恢復(fù)正常。BLM組和BLM+P組的光鏡

5、改變相似，7d時(shí)兩組動(dòng)物肺泡間隔有明顯的水腫，肺泡萎陷、毛細(xì)血管增多，間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多；14d時(shí)仍為肺泡炎表現(xiàn)；28d時(shí)肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維呈索條狀沉積于毛細(xì)血管周?chē)?，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔消失。 2、透射電鏡觀(guān)察：對(duì)照組肺泡上皮和血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量吞飲小泡，基底膜呈連續(xù)線(xiàn)狀。7d時(shí)PMDC組肺泡腔內(nèi)仍可見(jiàn)肺炎雙球菌，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞變性壞死，基膜不清。28d時(shí)仍有少量肺組織肺泡腔擴(kuò)張，間隔部

6、分?jǐn)嗔?，毛?xì)血管內(nèi)皮、基膜完整。PMDC+P組第7d時(shí)肺內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞增生、部分肺泡腔出血，Ⅱ型細(xì)胞增生；28d時(shí)毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜完整，Ⅱ型細(xì)胞形態(tài)完整，間質(zhì)膠原纖維正常。7d時(shí)BLM+P組肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞脫落明顯，細(xì)胞連接不清；間質(zhì)膠原纖維和彈性纖維多，肺泡腔有明顯出血、滲出，并伴有大量纖維素滲出和膿液；28d時(shí)以肺泡壁增厚、膠原纖維、彈性纖維和成纖維細(xì)胞增多為主要特征，并有大量Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，此時(shí)肺纖維化已經(jīng)形成，較多肺泡

7、結(jié)構(gòu)已破壞，纖維組織增生明顯。 3、免疫組織化學(xué)染色及定量分析：對(duì)照組大鼠肺內(nèi)VEGF主要定位于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、血管壁平滑肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。PMDC組3d時(shí)可見(jiàn)肺間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，肺泡巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞也有表達(dá)。7d時(shí)PMDC、BLM和BLM+P組大鼠肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性區(qū)面積比值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；BLM+P組肺內(nèi)間

8、質(zhì)細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的VEGF陽(yáng)性區(qū)面積比值明顯高于PMDC+P組(P＜0.05)。14d時(shí)PMDC和PMDC+P組肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；而B(niǎo)LM和BLM+P組肺泡上皮細(xì)胞、肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中VEGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性區(qū)面積比值顯著高于對(duì)照組和PMDC+P(P＜0.01)。28d時(shí)，PMDC和PMDC+P組肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中VEG

9、F的表達(dá)水平已與對(duì)照組相同；BLM和BLM+P組肺內(nèi)3種成分中VEGF的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)和PMDC+P組(P＜0.05)。對(duì)照組TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)主要定位和分布于肺泡和間質(zhì)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，少量陽(yáng)性細(xì)胞位于細(xì)支氣管和肺間質(zhì)血管周?chē)?d時(shí)實(shí)驗(yàn)各組肺內(nèi)TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而B(niǎo)LM+P組和PMDC+P組之間差異不明顯(P＞0.05)。14d時(shí)BLM組和BLM+P組肺

10、泡及間質(zhì)中TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞比分比繼續(xù)升高、與對(duì)照組和PMDC+P組相差顯著(P＜0.01；P＜0.05)；而PMDC+P組TGF-β1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差別(P＞0.05)。28d時(shí)BLM組和BLM+P組肺泡及間質(zhì)中TGF-β1免疫反應(yīng)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞比率仍維持在14d時(shí)的水平、與對(duì)照組和PMDC+P組相差顯著(P＜0.01)。 研究結(jié)論： 1、VEGF持續(xù)高表達(dá)與大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)，而血管內(nèi)

11、皮細(xì)胞的損傷可能是BLM誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動(dòng)因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 2、TGF-β1在BLM肺損傷和PMDC肺炎早期肺內(nèi)巨噬細(xì)胞中均出現(xiàn)高表達(dá)，BLM肺損傷過(guò)程中TGF-β1的持續(xù)高表達(dá)，而PMDC肺炎的中后期TGF-β1的表達(dá)接近正常水平。TGF-β1的持續(xù)高表達(dá)可能與血管損傷修復(fù)及血管新生密切相關(guān)。 3、BLM與肺炎雙球菌所致肺損傷的分子機(jī)制不同。即前者導(dǎo)致的肺損傷是不可逆的，伴有TGF-β1和VEGF的持續(xù)高表達(dá)；