雞PPARγ基因的mRNA 5’端克隆、表達及調控分析.pdf

1、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)是核受體超家族成員之一。PPARγ在動物機體中作用廣泛，是脂肪細胞分化和脂質代謝網(wǎng)絡的關鍵調控因子，與肥胖癥及其相關疾病關系密切。雞PPARγ基因的結構還不是完全清楚，目前NCBI數(shù)據(jù)庫中只有一條雞PPARγ基因的轉錄本，通過5'RACE分析發(fā)現(xiàn)雞PPARγ基因有5個不同的轉錄本，它們的唯一差異是5'端末端序列不同。開放閱讀框（Open reading frame）分析發(fā)現(xiàn)，雞的這5個轉錄本能編碼

2、兩個蛋白亞型或蛋白異構體，即cPPARγ1和cPPARγ2蛋白，這兩種蛋白的差別僅是它們的N端存在6個氨基酸的差異。
　　實時熒光定量PCR分析了雞PPARγ基因5個轉錄本的組織表達模式，結果顯示cPPARγ1在脂肪組織，心臟，肝臟，脾臟，腎臟和十二指腸中表達很高，在肺臟，大腦和胰腺中少量表達，而在胸肌和腺胃中表達量極低;與cPPARγ1相比，cPPARγ2，cPPARγ3，cPPARγ4和cPPARγ5在所有組織包括脂肪組織中的

3、表達都相對較低，比較而言，cPPARγ2在脂肪中的表達量相對較高，呈現(xiàn)一定的脂肪組織特異性;cPPARγ3在脂肪組織，腎臟，脾臟和肝臟中表達豐富。cPPARγ4和cPPARγ5在所有組織中表達量都很低，其中cPPARγ5在脂肪組織，心臟，肝臟和腎臟中的表達量豐富;高低脂雞腹部脂肪組織的表達分析發(fā)現(xiàn)，cPPARγ1在2到7周齡高脂雞脂肪組織中的表達極顯著高于低脂雞(P＜0.01);而cPPARγ3在3、5周齡和4、6周齡高脂雞脂肪組織中的

4、表達要顯著(P＜0.05)或極顯著高于低脂雞(P＜0.01);cPPARγ5在3、4、6周齡的高脂雞脂肪組織表達極顯著高于低脂雞(P＜0.01)，在2、7周齡的表達水平達到顯著(P＜0.05)。
　　根據(jù)雞的5個轉錄本序列信息，利用UCSC genome browser分析顯示，雞PPARγ基因有3個不同的啟動子（P1、P2及P3），其中P1能啟動雞cPPARγ1的轉錄，P2能啟動雞cPPARγ2，cPPARγ3和cPPARγ4的

5、轉錄，P3能啟動雞cPPARγ5的轉錄。生物信息學的方法分析了雞P1、P2啟動子區(qū)2kb的序列，發(fā)現(xiàn)P1、P2均含有GC-box元件，其中P1含有有很多的C/EBP家族，NFKPB，AP2等與脂肪分化相關的轉錄因子結合位點;其中P2也發(fā)現(xiàn)一些C/EBP家族，AP2等一些脂肪相關轉錄因子;截短突變分析發(fā)現(xiàn)在P1啟動子區(qū)域（-577/+109）顯示非常強熒光素酶活性(P＜0.01);同樣在在P2啟動子區(qū)域(-671/+140)顯示很強的熒光

6、素酶活性(P＜0.05);
　　通過生物信息學的方法分析發(fā)現(xiàn)雞P1和P2啟動子區(qū)分別存在一個大的CpG島。利用甲基化酶抑制劑（5'-aza-2'-deoxycytidine）處理DF1細胞和雞前脂肪細胞，real-timeRT-PCR檢測分析5個cPPARγ轉錄本的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，甲基化酶抑制劑處理DF1細胞之后，雞PPARγ的5個轉錄本都有不同程度的上升，(PPARγ1，PPARγ2，PPARγ3，PPARγ4在24，48，

7、72，96h的表達都呈現(xiàn)上升趨勢，其中96h時PPARγ1和PPARγ3表達顯著升高(P＜0.05)，PPARγ4達到極顯著水平(P＜0.01);而在前脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)，與0h相比，前脂肪細胞處理后24，48，72，96h后PPARγ1的表達量持續(xù)升高，并在96h時達到顯著(P＜0.05)，其他轉錄本在不同時間點雖然呈現(xiàn)一定的上升趨勢，但是表達并沒有明顯的趨勢。使用甲基化轉移酶(M.SssⅠ)處理包含雞PPARγ基因3個啟動子報告基因質粒