NLRC5的甲基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞表型變化的調(diào)控作用和部分機(jī)制研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是先天免疫反應(yīng)中必不可少的組成成分，它來源于外周血中的單核細(xì)胞，當(dāng)單核細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移和通過內(nèi)皮細(xì)胞外滲，進(jìn)一步分化成各種組織駐留的巨噬細(xì)胞。類似于Th1/Th2細(xì)胞分化，巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境下也可以分化為兩種成熟的表型，通常被稱作M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞也稱之為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，可由干擾素γ（IFN-γ）或與脂多糖（LPS）共同刺激產(chǎn)生，而M2型（即選擇性活化的巨噬細(xì)胞）可由各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)，包括IL-4

2、、IL-13和免疫復(fù)合物等。一般來說，M1型活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-23，低表達(dá)IL-10;代謝精氨酸，產(chǎn)生高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），此外M1型巨噬細(xì)胞分泌大量的促炎因子如IL-1β，IL-6和TNF-α等。相反，M2型活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-10，低表達(dá)IL-12和Il-23，并產(chǎn)生精氨酸酶。更重要的是，這兩種表型的巨噬細(xì)胞具有復(fù)雜的異質(zhì)性和功能的多樣性，其中許多特征相互矛盾：包括促炎癥活性和抗炎活性，促

3、腫瘤活性和抗腫瘤活性，免疫原性和免疫耐受性，還有組織破壞性和組織修復(fù)性。
　　上述的這些表型和功能變化的巨噬細(xì)胞對(duì)于很多疾病都具有重要作用，例如肝纖維化、腫瘤、肥胖癥等。靶向巨噬細(xì)胞表型變化并針對(duì)這些疾病的微環(huán)境來相應(yīng)地改變巨噬細(xì)胞的表型可能成為治療疾病的新的希望。
　　但是目前巨噬細(xì)胞的表型變化以及潛在的機(jī)制尚未明確。NOD樣受體家族是最近被發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)中的一個(gè)模式識(shí)別受體，已經(jīng)被證明可以調(diào)控炎癥反應(yīng)和Ⅰ類 MHC轉(zhuǎn)錄。

4、本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn) NOD樣受體家族的成員之一，NLRC5（由氨基酸的CARD樣區(qū)域、中間的NOD樣區(qū)和羧基端的亮氨酸重復(fù)序列區(qū)域三部分組成）對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌有著負(fù)性調(diào)控的作用，也證實(shí)了NLRC5對(duì)肝纖維化的作用及可能機(jī)制（NF-κB信號(hào)通路）。根據(jù) NLRC5能夠有效抑制機(jī)體的天然免疫和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步探索NLRC5是否對(duì)巨噬細(xì)胞表型變化起到調(diào)控作用并探討潛在的機(jī)制，本研究主要分為以下幾個(gè)部分：
　　1.建立RAW26

5、4.7細(xì)胞的M1和M2兩種表型變化模型。
　　選用RAW264.7（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株）為研究對(duì)象，使用LPS（1000 ng/ml）和IFN-γ（10ng/ml）共同作用12 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，而使用IL-4（15 ng/ml）刺激細(xì)胞向M2型變化。
　　2. NLRC5在兩種表型變化巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是RAW264.7細(xì)胞，分別用RTq-PCR和Western Blot法檢測(cè)NLRC5

6、在兩種表型變化的巨噬細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，M1表型的巨噬細(xì)胞中NLRC5的表達(dá)降低，而M2中NLRC5的表達(dá)升高，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. NLRC5的下游調(diào)控機(jī)制研究。
　　實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是RAW264.7細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道Notch信號(hào)通路在M1型巨噬細(xì)胞表型變化中起到重要的作用，本文通過脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染NLRC5 RN

7、Ai和pEGFP-C2-NLRC5后使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，Western Blot法檢測(cè)NLRC5沉默和過表達(dá)后Notch1以及下游蛋白Hes1的表達(dá)，結(jié)果提示NLRC5調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能是由Notch信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　4. NLRC5的上游調(diào)控機(jī)制研究。
　　以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，RT-qPCR和Western Blot結(jié)果顯示在M1型表型變化的巨噬細(xì)胞給予甲基化抑制劑（5-azadC）可