Th17細(xì)胞在博萊霉素致系統(tǒng)性硬化病伴肺纖維化小鼠模型中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Th17細(xì)胞在博萊霉素致系統(tǒng)性硬化病伴肺纖維化小鼠模型中的表達(dá)和意義
　　目的：研究Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子在博萊霉素(BLM)致系統(tǒng)性硬化病(SSc)伴肺纖維化(PF，SSc-PF)小鼠模型中的表達(dá)，探討它們是否參與SSc及SSc-PF的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：將30只雌性BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:對(duì)照組10只，BLM皮下注射建立SSc模型組20只，根據(jù)PF(Ashcroft)半定量評(píng)分，＜3級(jí)為SS

2、c輕度PF組（SSc-A組）和≥3級(jí)SSc中重度PF組(SSc-B組)。HE和Masson's染色觀察小鼠背部注射部位皮膚和肺部病理改變，炎癥和纖維化評(píng)分并測定羥脯氨酸(HYP)的含量。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測小鼠外周血、皮膚和肺組織CD4+IL-17+(Th17)細(xì)胞的比例;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測皮膚和肺組織維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體gammat t(RORγt)、白細(xì)胞介素(IL)-17A、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1mRNA的表達(dá)

3、水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定外周血IL-17A、TGF-β1的含量，并分析這些指標(biāo)與皮膚及肺部炎癥及纖維化的相關(guān)性。
　　結(jié)果：(1)20只模型小鼠Ashcroft評(píng)分:0-2級(jí)有9只，為SSc-A組，≥3級(jí)有11只，為SSc-B組。皮膚、肺組織病理切片HE染色和Masson's染色顯示，對(duì)照組小鼠皮膚和肺組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤及膠原增生;模型組小鼠皮膚明顯增厚，炎癥細(xì)胞浸潤，附屬器萎縮，膠原明顯增生，SSc

4、-A組肺部結(jié)構(gòu)無明顯破壞，肺泡和支氣管壁無或少量纖維性增厚，SSc-B組肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁中度以上纖維性增厚或纖維束形成，部分肺結(jié)構(gòu)破壞，多量淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤。皮膚炎癥、肺部炎癥和PF評(píng)分SSc-B組(2.82±0.75，2.36±0.81和4.0±1.41)，SSc-A組(2.44±0.73，1.33±0.50和1.56±0.73)比對(duì)照組(0.40±0.52，0.40±0.52和0.60±0.70)明顯增加（均P＜0.

5、05）;肺HYP含量SSc-B組(0.64±0.08)mg/g較SSc-A組(0.45±0.08)mg/g及對(duì)照組(0.38±0.16) mg/g明顯增多;皮膚HYP含量SSc-B組(3.07±1.66) mg/g，SSc-A組(2.44±0.61)mg/g較對(duì)照組(1.45±0.40) mg/g明顯增加，均P＜0.05。(2) Th17細(xì)胞比例，外周血和皮膚SSc-B組[（1.61±0.49）％，（3.48±1.59）％]，SSc-A

6、組[（1.36±0.51）％，（2.89±1.55)％]較對(duì)照組[（0.85±0.23）％，（1.28±0.37）％]明顯增加;肺組織SSc-B組（3.83±1.44）％較SSc-A組（2.30±0.98）％及對(duì)照組（1.32±0.37）％明顯增高，均P＜0.05。(3)皮膚SSc-B和SSc-A組IL-17A、RORγt和TGF-β1mRNA的表達(dá)量均較對(duì)照明顯增高;肺組織SSc-B組IL-17A、RORγt、TGF-β1 mRNA的

7、表達(dá)量的校正值分別為(2.79±2.16)、(30.54±32.97)和(0.24±0.23)較對(duì)照組(0.19±0.35)、(2.04±4.46)和(0.03±0.03)明顯增加，SSc-B組IL-17AmRNA的表達(dá)量較SSc-A組增加，均P＜0.05。(4)外周血IL-17A和TGF-β1的含量SSc-B組[(72.45±5.05)pg/ml，(1397.02±157.64)pg/ml]，SSc-A組[(70.83±5.05)pg

8、/ml，(1382.72±161.77)pg/ml]較對(duì)照組[(63.89±4.48)pg/ml，(1165.76±140.44)pg/ml]明顯增高，均P＜0.01。(5)外周血Th17細(xì)胞與皮膚及肺部炎癥、皮膚及肺HYP含量、外周血IL-17A含量密切正相關(guān)(r值為0.499、0.604、0.387、0.374、0.560，均P＜0.05);肺組織Th17細(xì)胞與肺部炎癥、肺HYP含量、肺組織IL-17A mRNA的表達(dá)量密切正相關(guān)(

9、r值為0.683、0.663、0.605，均P＜0.01);皮膚Th17細(xì)胞與皮膚炎癥、皮膚HYP含量、皮膚IL-17A mRNA的表達(dá)量密切正相關(guān)（r值為0.632、0.544、0.406，均P＜0.05）;外周血IL-17A的含量與皮膚及肺部炎癥、皮膚及肺HYP含量、外周血TGF-β1含量密切正相關(guān)（r值為0.728、0.642、0.652、0.650、0.401，均P＜0.05），肺組織IL-17A mRNA的表達(dá)量與肺組織TGF

10、-β1mRNA的表達(dá)量（r值為0.801，P＜0.001），皮膚IL-17A mRNA的表達(dá)量與皮膚TGF-β1mRNA的表達(dá)量（r值為0.620，P＜0.001）密切正相關(guān)。
　　結(jié)論：Th17細(xì)胞和IL-17A在SSc小鼠模型外周血、皮膚及肺組織表達(dá)增高并伴活性增強(qiáng)，以SSc伴明顯PF小鼠更為顯著，與皮膚和肺部炎癥和纖維化病變密切相關(guān)，Th17細(xì)胞可能通過分泌IL-17A與TGF-β1相互作用，共同參與SSc和SSc-PF炎癥

11、和纖維化病變。
　　第二部分CCR6/CCL20對(duì)博萊霉素致系統(tǒng)性硬化病伴肺纖維化小鼠Th17細(xì)胞趨化作用的研究
　　目的：研究Th17細(xì)胞趨化因子受體及相應(yīng)的配體CCR6/CCL20在SSc小鼠外周血、皮膚、肺組織的表達(dá)情況及相關(guān)細(xì)胞因子水平，探討CCR6/CCL20對(duì)SSc小鼠Th17細(xì)胞的趨化作用。
　　方法：將30只雌性BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:對(duì)照組10只，模型組:SSc A組和SSc B組（同

12、第一部分）。HE和Masson's染色觀察小鼠背部注射部位皮膚和肺部病理改變，炎癥和纖維化評(píng)分及羥脯氨酸(HYP)含量的測定。流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血、皮膚和肺組織CD4+CCR6+、CD4+CCR6+IL-17+細(xì)胞的百分比。RT-PCR檢測皮膚、肺組織CCL20、IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表達(dá)水平，ELISA檢測外周血CCL20、IL-17A、TGFβ1、IL-6的含量，并分析這些指標(biāo)的相互關(guān)系。
　　結(jié)果：(

13、1)皮膚炎癥、肺部炎癥和PF評(píng)分SSc-B組(2.82±0.75，2.36±0.81和4.0±1.41)，SSc-A組(2.44±0.73，1.33±0.50和1.56±0.73)比對(duì)照組(0.40±0.52，0.40±0.52和0.60±0.70)明顯增加（均P＜0.05）;肺HYP含量SSc-B組(0.64±0.08)mg/g較SSc-A組(0.45±0.08) mg/g及對(duì)照組(0.38±0.16) mg/g明顯增多;皮膚HYP含

14、量SSc-B組(3.07±1.66) mg/g，SSc-A組(2.44±0.61)mg/g較對(duì)照組(1.45±0.40) mg/g明顯增加，均P＜0.05。(2)與對(duì)照組比較，SSc-B組外周血、肺組織、皮膚CD4+CCR6+細(xì)胞比例增加;外周血、皮膚SSc-B組CD4+CCR6+IL-17A+細(xì)胞比例[（0.18±0.07）％，（0.36±0.16）％]和SSc-A組[(0.19±0.07)％，（0.33±0.17）％]較對(duì)照組[（0

15、.11±0.03）％，(0.15±0.05)％]增加，SSc-B組肺組織CD4+CCR6+IL-17A+細(xì)胞比例（0.48±0.32）％較SSc-A（0.29±0.24）％和對(duì)照組（0.25±0.15）％增加（均P＜0.05）;SSc-B組皮膚和肺組織CCL20mRNA的表達(dá)和外周血CCL20的含量明顯增高（均P＜0.05）。(3)外周血CD4+CCR6+IL-17A+細(xì)胞比例與皮膚和肺部炎癥，肺HYP的含量，CCL20含量密切正相關(guān)（

16、r值為0.409、0.435、0.414、0.494，均P＜0.05）;肺組織和皮膚CD4+CCR6+IL-17A+細(xì)胞的比例分別與肺部和皮膚炎癥、肺部和皮膚HYP含量，肺部和皮膚CCL20mRNA的表達(dá)量密切正相關(guān)（r值為0.376～0.738，均P＜0.05）。(4)與對(duì)照組比較，SSc-B組和SSc-A肺組織、皮膚IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表達(dá)量和外周血的含量明顯增加，均P＜0.05。外周血、肺組織CD4+CCR

17、6+IL-17A+細(xì)胞和CCL20的表達(dá)量與IL-17A、TGFβ1、IL-6表達(dá)量密切正相關(guān)（r值為0.400～0.781，均P＜0.05）。皮膚CD4+CCR6+IL-17A+細(xì)胞與IL-17A、TGFβ1、IL-6mRNA的表達(dá)量正相關(guān)（r值為0.545，0.436、0.400，均P＜0.05）。
　　結(jié)論：Th17細(xì)胞可通過CCR6/CCL20趨化作用聚集在SSc-PF小鼠的皮膚及肺部病變部位，這種趨化作用是Th17細(xì)胞表

18、達(dá)增加的原因之一，隨PF病變程度的加重而增強(qiáng)。
　　第三部分系統(tǒng)性硬化病小鼠CD4+T細(xì)胞IL-21的表達(dá)及IL-21和TGF-β1對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響
　　目的：觀察SSc小鼠外周血、皮膚、肺組織中CD4+IL-17+L-21+和CD4+IL-21R+細(xì)胞的比例，研究IL-21和TGF-β1對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響，進(jìn)一步明確SSc中Th17細(xì)胞增加的原因及作用機(jī)制。
　　方法：將

19、30只雌性BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:對(duì)照組10只，模型組:SSc-A組和SSc-B組（同第一部分）。HE和Masson's染色觀察小鼠背部注射部位皮膚和肺部病理改變，炎癥和纖維化評(píng)分及羥脯氨酸(HYP)含量的測定。流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血、皮膚和肺組織中CD4+IL-17+IL-21+細(xì)胞、CD4+IL-21R+細(xì)胞比例，ELISA檢測外周血IL-21的含量。無菌取SSc小鼠脾臟，磁珠分選CD4+T細(xì)胞，分別用rIL-21

20、(50μg/L，IL-21組),TGF-β1(10μg/L,TGF-β1組),IL-21(50μg/L)+TGF-β1(10μg/L)(IL-21TGF-β1組)和空白對(duì)照組進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)，72小時(shí)后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組Th17細(xì)胞數(shù)，RT-PCR檢測培養(yǎng)細(xì)胞RORγt、IL-17AmRNA的表達(dá)水平，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IL-17A的水平。
　　結(jié)果：(1)皮膚炎癥及HYP含量、肺部炎癥和PF評(píng)分SSc-B組，S

21、Sc-A組比對(duì)照組明顯增加（均P＜0.05）;肺HYP含量SSc-B組較SSc-A組及對(duì)照組明顯增多，同第一部分。(2)外周血、肺組織、皮膚CD4+IL-17+IL-21+細(xì)胞的百分比:SSc-B組為[（0.11±0.06）％，(0.13±0.05)％，(0.15±0.09)％]，SSc-A組[（0.10±0.06）％，（0.06±0.03）％，（0.16±0.10）％]比對(duì)照組[（0.02±0.02）％，（0.02±0.02）％，（0

22、.00±0.01）％]明顯增加，SSc-B組肺組織較SSc-A組明顯增加，均P＜0.05。外周血、肺組織、皮膚CD4+IL-21R+的百分比:SSc-B組為[（0.89±0.42）％，（1.56±0.39）％，（2.17±1.02）％]，SSc-A組[（0.84±0.24）％，(1.50±0.50)，（2.17±0.98）％]比對(duì)照組[（0.51±0.18）％，（1.03±0.40）％，（1.13±0.52）％]明顯增加，均P＜0.05

23、。外周血IL-21的含量SSc-B組[(136.68±40.61) pg/ml]，SSc-A組[(125.42±47.88)pg/ml]和較對(duì)照組[(76.89±26.46)pg/ml]明顯增加，均P＜0.05。(3)外周血CD4+IL-17+IL-21+和CD4+IL-21R+細(xì)胞的比例與皮膚和肺組織炎癥，PF評(píng)分、外周血IL-21含量密切正相關(guān)（r值為0.383～0.668，均P＜0.05）。皮膚CD4+IL-17+IL-21+細(xì)胞

24、的比例與皮膚HYP密切正相關(guān)（r值為0.523，P=0.003）。肺組織CD4+IL-17+IL-21+和CD4+ IL-21R+細(xì)胞的比例與肺部炎癥及HYP含量密切正相關(guān)（r值為0.444～0.767，均P＜0.05）。外周血IL-21的含量與皮膚和肺組織炎癥，肺HYP的含量，外周血CD4+IL-17+IL-21+細(xì)胞密切正相關(guān)(r值為0.395～0.514，均P＜0.05)。(4) SSc小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果:Th17細(xì)胞

25、比例IL-21組（3.34±1.18）％、IL-21TGF-β1組（5.85±2.45）％較對(duì)照組（1.44±0.34）％明顯增加，IL-21組和IL-21TGF-β1組IL-17A和RORγtmRNA的表達(dá)量，細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-17A的含量較對(duì)照組明顯增加，均P＜0.05。
　　結(jié)論: SSc小鼠外周血、皮膚和肺組織中CD4+IL-17+IL-21+與CD4+IL-21R+的比例增高，Th17細(xì)胞可分泌IL-21，通過IL-2

26、1/IL-21R作用于SSc小鼠皮膚和肺部炎癥和纖維化病變;IL-21可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，聯(lián)合TGF-β1作用更強(qiáng)。
　　第四部分體外IL-17A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及分泌功能的影響
　　目的：觀察IL-17A、TGF-β1對(duì)成纖維細(xì)胞(FB)增殖及分泌的影響及它們之間的相互作用，進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞在系統(tǒng)性硬化病(SSc)纖維化形成中的作用。
　　方法：選用SSc小鼠肺FB原代培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡觀

27、察形態(tài)，波形蛋白免疫組化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行純度鑒定。用MTT法觀察不同濃度IL-17A、TGF-β124小時(shí)內(nèi)對(duì)FB增殖活性的影響，尋找最適的濃度。FB與(1)IL-17A;(2)TGF-β1;(3)IL-17A+TGF-β1;(4)DMEM培養(yǎng)液4組共培養(yǎng)。Brdu ELISA方法檢測24h、48h、72h FB的增殖活性;RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡(Western blot法檢測FB分泌Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)和蛋白濃度;ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)

28、上清液IL-6水平。RT-PCR和ELISA檢測(1)和(4)組TGF-β1mRNA的表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGF-β1含量。
　　結(jié)果：(1)培養(yǎng)的肺組織塊緊密貼壁，倒置顯微鏡下觀察組織塊為暗黑色遮光區(qū)域，4-10d天可見周圍有單個(gè)細(xì)胞游出，以梭形為主，細(xì)胞逐漸密集，11-20d細(xì)胞可傳代，波形蛋白免疫組化染色為陽性。(2)MTT法顯示:24h內(nèi)IL-17A、TGF-β1隨濃度增加均有促進(jìn)FB增殖的作用，IL-17A在25μg/L

29、，TGF-β1在12.5μg/L時(shí)對(duì)FB增殖活性作用最大。(3)Brdu ELISA顯示:與正常對(duì)照組比較，加入IL-17A、TGF-β1細(xì)胞因子后，24、48、72hFB增殖活性逐漸增強(qiáng)，組內(nèi)因素時(shí)間效應(yīng)的F值773.040，組間因素效應(yīng)的F值140.739，均P＜0.01，IL-17A聯(lián)合TGF-β1作用最強(qiáng)。(4)與正常對(duì)照組比較，加入IL-17A、TGF-β1細(xì)胞因子后，24、48、72h FB分泌Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)和蛋白的濃

30、度逐漸增多，呈時(shí)間依賴性，組內(nèi)因素時(shí)間效應(yīng)的F值分別為55.242，202.817，組間因素效應(yīng)的F值80.062，149.710，均P＜0.001，IL-17A聯(lián)合TGF-β1組尤為明顯。(5)與正常對(duì)照組比較，加入IL-17A、TGF-β1細(xì)胞因子后，24、48、72h細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-6水平明顯增多，組內(nèi)因素時(shí)間效應(yīng)的F值69.145，組間因素效應(yīng)的F值159.62，均P＜0.01。(6)與對(duì)照組比較，加入IL-17A細(xì)胞因子后

31、，24、48、72h FB TGF-β1mRNA表達(dá)量增加，組內(nèi)因素時(shí)間效應(yīng)的F值8.71，組間因素效應(yīng)的F值65.880，均P＜0.05。細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGF-β1水平增加，組內(nèi)因素時(shí)間效應(yīng)的F值22.71，組間因素效應(yīng)的F值170.496，均P＜0.01。
　　結(jié)論：IL-17A可促進(jìn)FB增殖及分泌Ⅰ型膠原和IL-6，呈時(shí)間依賴性，聯(lián)合TGF-β1作用更強(qiáng)，IL-17A可增強(qiáng)FB分泌TGF-β1，它們?cè)赟Sc纖維化病變中具有協(xié)