RNAi沉默CD147基因對人喉癌細胞增殖、侵襲、順鉑敏感性及體內致瘤性的影響.pdf

1、目的:CD147,又名基質金屬蛋白酶誘導因子,屬于免疫球蛋白超家族的細胞膜表面高糖基化蛋白,在許多惡性腫瘤中表達增高,能促進腫瘤的存活、生長、侵襲與轉移。CD147高表達還能提高腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。相關研究報道,CD147在喉癌細胞株Hep2中高表達,因此利用本實驗室前期構建的CD147ShRNA真核表達載體,利用RNAi技術高效特異地沉默喉癌細胞株Hep2中CD147的表達,以分析其在喉癌侵襲、轉移及其對順鉑敏感性的作用機制。

2、
　　 研究方法:
　　 1)將前期構建的重組質粒pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2穩(wěn)定轉染至Hep2細胞中,采用RT-PCR法和Western法分別檢測轉染細胞中CD147mRNA和蛋白表達的變化；
　　 2)采用MTT法檢測轉染pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/s

3、hRNA2后Hep2細胞增殖水平的變化及其對化療藥物順鉑的敏感性；
　　 3)采用Transwell法檢測CD147shRNA對Hep2細胞的體外侵襲能力的影響；
　　 4)采用明膠酶譜法檢測轉染pSilencer/shRNA—control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2后Hep2細胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的活力；
　　 5)采用裸鼠皮下異種移植模型觀察CD147sh

4、RNA對Hep2細胞在體內侵襲和轉移能力的影響。
　　 結果:
　　 1)所構建載體經陽離子脂質體介導轉染人喉癌細胞株Hep2,G418篩選后有限稀釋法成功獲得陽性克隆株,RT-PCR法和western法顯示兩組ShRNA均高效而特異地沉默了喉癌細胞Hep2中CD147的表達。
　　 2)MTT結果顯示,在轉染72h、96h、120h后,Hep2/shRNAl和Hep2/shRNA2組細胞增殖能力分別下降到了77

5、.34％(P<0.01)和70.43％(P<0.01),62.99％(P<0.01)和73.76％(P<0.01),67.49％(P<0.01)和61.37％(P<0.01)。Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細胞對順鉑敏感性也明顯增高。
　　 3)細胞體外侵襲力測定結果顯示:Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細胞的穿膜細胞數(shù)低于Hep2和Hep2/shRNA-control組。
　　 4)明

6、膠酶譜結果顯示:Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組的MMP-2和MMP-9明膠酶活性顯著降低。
　　 5)Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細胞在裸鼠皮下的成瘤體積較H印2組分別降低至38.35％和36.08％o
　　 結論:
　　 1)RNAi技術特異性沉默Hep2細胞CD147表達后,細胞增殖能力受到明顯抑制,說明CD147能促進喉癌細胞的生長。
　　 2)RNA技術特異性