RNAi沉默CD147基因?qū)θ撕戆┘?xì)胞增殖、侵襲、順鉑敏感性及體內(nèi)致瘤性的影響.pdf

1、目的:CD147,又名基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子,屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞膜表面高糖基化蛋白,在許多惡性腫瘤中表達(dá)增高,能促進(jìn)腫瘤的存活、生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移。CD147高表達(dá)還能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。相關(guān)研究報(bào)道,CD147在喉癌細(xì)胞株Hep2中高表達(dá),因此利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的CD147ShRNA真核表達(dá)載體,利用RNAi技術(shù)高效特異地沉默喉癌細(xì)胞株Hep2中CD147的表達(dá),以分析其在喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移及其對(duì)順鉑敏感性的作用機(jī)制。

2、
　　 研究方法:
　　 1)將前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hep2細(xì)胞中,采用RT-PCR法和Western法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD147mRNA和蛋白表達(dá)的變化；
　　 2)采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/s

3、hRNA2后Hep2細(xì)胞增殖水平的變化及其對(duì)化療藥物順鉑的敏感性；
　　 3)采用Transwell法檢測(cè)CD147shRNA對(duì)Hep2細(xì)胞的體外侵襲能力的影響；
　　 4)采用明膠酶譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pSilencer/shRNA—control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2后Hep2細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的活力；
　　 5)采用裸鼠皮下異種移植模型觀察CD147sh

4、RNA對(duì)Hep2細(xì)胞在體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1)所構(gòu)建載體經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞株Hep2,G418篩選后有限稀釋法成功獲得陽(yáng)性克隆株,RT-PCR法和western法顯示兩組ShRNA均高效而特異地沉默了喉癌細(xì)胞Hep2中CD147的表達(dá)。
　　 2)MTT結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染72h、96h、120h后,Hep2/shRNAl和Hep2/shRNA2組細(xì)胞增殖能力分別下降到了77

5、.34％(P<0.01)和70.43％(P<0.01),62.99％(P<0.01)和73.76％(P<0.01),67.49％(P<0.01)和61.37％(P<0.01)。Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性也明顯增高。
　　 3)細(xì)胞體外侵襲力測(cè)定結(jié)果顯示:Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)低于Hep2和Hep2/shRNA-control組。
　　 4)明

6、膠酶譜結(jié)果顯示:Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組的MMP-2和MMP-9明膠酶活性顯著降低。
　　 5)Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2組細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤體積較H印2組分別降低至38.35％和36.08％o
　　 結(jié)論:
　　 1)RNAi技術(shù)特異性沉默Hep2細(xì)胞CD147表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制,說(shuō)明CD147能促進(jìn)喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 2)RNA技術(shù)特異性