MACC1基因沉默對卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機制探討.pdf

1、研究背景：
　　上皮性卵巢癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，為引起婦女死亡的第五大腫瘤，全球發(fā)病率逐年增加，且有年輕化的趨勢。由于卵巢癌起病隱匿，缺乏早期篩查手段，大部分患者初診即為晚期，錯過了手術(shù)治療的機會。雖然早期卵巢癌患者5年生存率為70％~90%，但其診斷率卻只20%左右，況且術(shù)后極易復發(fā)及轉(zhuǎn)移，術(shù)后轉(zhuǎn)移及復發(fā)仍是臨床上管理患者所遇到的最大挑戰(zhàn)。因此，卵巢癌的轉(zhuǎn)移及復發(fā)是臨床醫(yī)生和科研工作者普遍重視的問題，為研究的熱點。

2、>　　越來越多的研究證明，腫瘤細胞內(nèi)某些基因活性的改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮著重要作用，其中腫瘤轉(zhuǎn)移基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因引起學者的廣泛關(guān)注和研究。MACC1作為在結(jié)腸癌中新發(fā)現(xiàn)的促腫瘤轉(zhuǎn)移基因，在體外研究中可明顯增強腫瘤細胞的化學趨向性和侵襲性，促進腫瘤細胞的遷移蠕動功能；在臨床研究中發(fā)現(xiàn) MACC1高表達結(jié)腸癌患者的生存期明顯縮短，低表達者的5年生存率為80%，而高表達者僅為15%。作為癌基因 C-MET的關(guān)鍵

3、調(diào)節(jié)因子之一，MACC1可能通過 HGF/C-MET信號通路來促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本實驗將研究 MACC1對卵巢癌惡性行為的影響和相關(guān)機制，為抑制卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的靶點和實驗依據(jù)。
　　研究目的：
　　利用小分子 RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建 MACC1基因瞬時沉默的人卵巢癌細胞株模型，觀察卵巢癌細胞體外增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成的變化及可能機制。
　　研究方法：
　　1.高表達 MACC1基因的卵巢癌細

4、胞株的篩選
　　應(yīng)用 RT-qPCR及 Western blot方法檢測4株不同轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細胞株：OVCAR3、ES-2、SKOV-3、HO-8910中 MACC1 mRNA及蛋白的表達情況。
　　2. siRNA的篩選及細胞轉(zhuǎn)染
　　針對 MACC1基因設(shè)計并合成靶向 siRNAs,轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞 OVCAR3，沉默MACC1基因，利用 RT-qPCR及 Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染 siRNA后 MA

5、CC1表達水平的變化，篩選出一條干擾效率最高的 siRNA，將此用于后續(xù)研究。
　　3.沉默 MACC1基因?qū)β殉舶┘毎忠u轉(zhuǎn)移的影響
　　采用 CCK8檢測細胞的體外增殖能力，采用黏附實驗檢測細胞黏附能力，Transwell侵襲實驗檢測細胞的體外侵襲能力，Transwell遷移實驗及劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，采用血管擬態(tài)實驗檢測細胞的體外血管形成能力。
　　4. MACC1影響卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究
　

6、　采用 Western blot方法檢測 C-MET蛋白表達的變化，構(gòu)建 C-MET啟動子核心區(qū)域的熒光素酶報告基因質(zhì)粒 pGL3-C-MET，探討 MACC1沉默后其活性的變化，從而研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控機理。
　　5.統(tǒng)計學分析
　　應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以X±s表示，比較采用 t檢驗和方差分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.成功篩選出 MACC

7、1基因高表達的人卵巢癌細胞株：OVCAR3。
　　2. siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，MACC1基因表達受到不同程度的抑制，其沉默效率最高達75.73%。與陰性對照組相比，干擾組轉(zhuǎn)染 MACC1-siRNA后24 h、48 h、72 h MACC1 mRNA分別下降了59.91%，75.45%，70.64%，蛋白表達水平分別下降60.22%,63.75%,54.94%。
　　3. MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞后，體外增殖、黏

8、附、侵襲、遷移和血管形成能力均較對照組減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4. MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞 OVCAR3后，熒光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn)：其下游靶基因 C-MET啟動子活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示：C-MET蛋白在干擾組表達下調(diào)，抑制率為41.5%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.抑制 MACC1基因的表