利用馬鈴薯內(nèi)生菌Bacillus megaterium PE1表達(dá)小鼠干擾素-γ和家蠶素Ⅱ的研究.pdf

1、隨著生物科技的進(jìn)步，植物不僅可以為人類提供傳統(tǒng)的天然產(chǎn)品，而且已成為表達(dá)有醫(yī)藥價(jià)值或工業(yè)用途的外源蛋白的良好生物反應(yīng)器，利用植物生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白，可將外源蛋白富集于種子、塊莖、塊根等組織器官中，有利于蛋白的分離純化。由于植物體表達(dá)外源蛋白易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)品獲取及加工相對(duì)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，因此受到人們的廣泛重視。但目前將外源基因?qū)胫参锏母鞣N方法均有一定的局限性，如操作繁瑣費(fèi)時(shí)、外源基因丟失、基因沉默等。因此，開發(fā)快速、簡(jiǎn)便、

2、低成本的外源基因轉(zhuǎn)化方法是研究的重要課題。植物內(nèi)生菌(endophyte)廣泛存在于各種植物組織內(nèi)，與宿主植物長(zhǎng)期互惠共生，人類的植食性食物中均含有內(nèi)生菌，說(shuō)明內(nèi)生菌對(duì)人體無(wú)害，符合食品安全要求，因此利用轉(zhuǎn)基因內(nèi)生菌在植物體內(nèi)表達(dá)外源基因可能是一條有效的途徑。前人利用工程內(nèi)生菌在宿主植物中表達(dá)的產(chǎn)物主要是抗蟲蛋白，而大腸桿菌、巨大芽孢桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)則只限于體外培養(yǎng)和表達(dá)。為此，本研究從馬鈴薯（Solanum tuberosum

3、）塊莖中分離到一株內(nèi)生細(xì)菌巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumPE1，并以此菌株作為外源基因表達(dá)菌，將小鼠（Mus musculus）干擾素-γ（interferonγ，IFNγ）基因和家蠶（Bombyx mori）的家蠶素Ⅱ(bombyxinⅡ，BBXⅡ)基因?qū)隑acillusmegaterium PE1中，進(jìn)而再回接至馬鈴薯中，測(cè)定了在體外培養(yǎng)及回接到馬鈴薯植株之后2種外源蛋白的表達(dá)情況及表達(dá)產(chǎn)物的生理活性。本研究的

4、主要目的旨在探討使用相對(duì)簡(jiǎn)單的原核生物轉(zhuǎn)化手段，繞過(guò)植物轉(zhuǎn)化的過(guò)程，利用內(nèi)生菌實(shí)現(xiàn)外源基因在植物中的表達(dá)，從而建立一種植物內(nèi)生菌-宿主植物新型表達(dá)系統(tǒng)。主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)對(duì)馬鈴薯塊莖中內(nèi)生菌進(jìn)行了分離、鑒定與優(yōu)勢(shì)菌篩選。首先比較了無(wú)菌水沖洗、75％乙醇、0.1％氯化汞以及次氯酸鈉幾種不同方法對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行表面滅菌的效果，確定用次氯酸鈉溶液效果最佳。對(duì)馬鈴薯塊莖中的內(nèi)生菌用LB培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)，共獲得27株內(nèi)生細(xì)菌(

5、編號(hào)分別為PE1-PE27)。對(duì)各菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果于GenBank進(jìn)行BLAST，利用GenBank上已登錄的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。經(jīng)同源性檢測(cè)，分離到的27個(gè)菌株分屬于4個(gè)屬的7個(gè)種，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)共有17株，假單胞菌屬（Pseudomonas）有5株，葡萄球菌屬(Staphylococcus)有3株，短狀桿菌屬（Brachybacterium）有2株，芽孢桿菌屬的菌株數(shù)占總分離菌株數(shù)的6

6、3.0％,表現(xiàn)出明顯的種群優(yōu)勢(shì)，而在芽孢桿菌屬的17個(gè)菌株中，有10株為巨大芽孢桿菌。而且巨大芽孢桿菌作為異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有良好的研究基礎(chǔ)和諸多優(yōu)勢(shì)。因此本研究將巨大芽孢桿菌PE1菌株作為表達(dá)外源基因的載體菌，定名為“Bacillusmegaterium PE1”。
　　(2)研究了溶菌酶濃度、酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)Bacillus megaterium PE1原生質(zhì)體形成率及再生率的影響。三種影響因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)

7、因素對(duì)PE1原生質(zhì)體形成率的影響與對(duì)再生率的影響呈相反趨勢(shì)。進(jìn)一步以原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積作為考察指標(biāo)，針對(duì)三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以確定最佳的處理?xiàng)l件，結(jié)果顯示，三種主要因子的影響程度依次為:溫度＞時(shí)間＞酶量。通過(guò)正交試驗(yàn)確定的Bacillusmegaterium PE1原生質(zhì)體最佳制備條件為:溶菌酶濃度4 mg/mL，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間90 min。
　　(3)研究了小鼠干擾素-γ基因(mIFN-γ)導(dǎo)入Bacillu

8、s megaterium PE1及其在體外和回接到馬鈴薯植株中的表達(dá)情況。首先克隆了小鼠干擾素-γ基因（mIFN-γ）的cDNA，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pHIS1522-mIFN-γ，以此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bacillus megateriumPE1，并用D-xylose誘導(dǎo)mIFN-γ的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE及ELISA檢測(cè)均表明，mIFN-γ在Bacillus megaterium PE1中獲得了表達(dá)，表達(dá)量為224.6229 mg/L。將

9、表達(dá)mIFN-γ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到馬鈴薯組培苗，回接5d、10d、15d、20 d后分別進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)到組培苗中有mIFN-γ的存在，說(shuō)明導(dǎo)入mIFN-γ基因的Bacillusmegaterium PE1菌株能夠在馬鈴薯組培苗中侵染、定殖，并可在馬鈴薯植株內(nèi)表達(dá)具有活性的外源蛋白。
　　(4)研究了家蠶素Ⅱ基因（BBX-Ⅱ）導(dǎo)入Bacillus megaterium PE1及其在體外和回接

10、到馬鈴薯植株中的表達(dá)情況。首先克隆了家蠶素Ⅱ基因(BBX-Ⅱ)的cDNA，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pHIS1522-BBX-Ⅱ，然后轉(zhuǎn)化Bacillus megaterium PE1，篩選攜帶BBX-Ⅱ的陽(yáng)性菌落，以D-xylose誘導(dǎo)BBX-Ⅱ的表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，BBXⅡ在Bacillus megaterium PE1中獲得了表達(dá)。將表達(dá)BBXⅡ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到馬鈴薯組培苗，回接5

11、d、10d、15d、20 d后分別進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)到組培苗中存在BBXⅡ，說(shuō)明導(dǎo)入BBX-Ⅱ基因的Bacillus megaterium PE1菌株能夠在馬鈴薯組培苗中侵染、定殖，并可在馬鈴薯植株內(nèi)表達(dá)BBXⅡ。
　　(5)對(duì)Bacillus megaterium PE1表達(dá)的BBXⅡ進(jìn)行了純化和生物活性鑒定。首先將Bacillus megaterium PE1表達(dá)的BBXⅡ利用親和層析獲得純化的BBXⅡ蛋白，配制BBXⅡ注射液，

12、并處理家蠶和小鼠。結(jié)果表明，BBXⅡ無(wú)論對(duì)正常家蠶、饑餓后進(jìn)食的家蠶還是飼喂高糖飼料誘導(dǎo)的高血糖家蠶，均具有降低血液海藻糖含量及提高海藻糖酶活性的作用。Bacillus megaterium PE1表達(dá)的BBXⅡ，對(duì)正常小鼠和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠也均有降血糖的生理活性，其效果與胰島素相近。
　　(6)本研究結(jié)果說(shuō)明，利用馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌Bacillus megaterium PE1作為外源基因表達(dá)菌，無(wú)論在體外還是回接到宿主馬

13、鈴薯植株內(nèi)，均能表達(dá)外源基因，獲得具有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物，因此建立一種植物內(nèi)生菌-宿主植物新型基因工程表達(dá)系統(tǒng)是可能的。這種表達(dá)系統(tǒng)具有構(gòu)建過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、內(nèi)生菌在宿主植物體內(nèi)擴(kuò)散快、用量少、通過(guò)常規(guī)無(wú)性繁殖方法可傳遞給后代、有些內(nèi)生菌具有多種宿主植物、對(duì)人安全無(wú)害等諸多優(yōu)勢(shì)，如將對(duì)人體有益的外源蛋白基因如疫苗、消化道防御性蛋白等導(dǎo)入內(nèi)生菌并使其在植物中表達(dá)，人食用之后可以起到藥食兩用的效果，將具有良好的開發(fā)前景。但對(duì)于導(dǎo)入外源基