錦囊升白沖劑對放化療后骨髓抑制再生的分子機制研究.pdf

1、目的:全球癌癥病人發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，手術(shù)、放療和化療仍是臨床上治療腫瘤的三大主要手段，而晚期癌癥病人及非實體瘤病人大多只能選擇放、化療治療。骨髓抑制是放、化療最常見的毒副反應，主要表現(xiàn)為白細胞減少，甚至可使全血細胞減少，嚴重影響了患者的治療效果。因此，如何有效增強骨髓抑制后再生是臨床上腫瘤治療中決定成敗的一個焦點問題。
　　 臨床上常用的升白細胞藥物有兩大類。西藥有以粒細胞集落刺激因子(G-CSF)為主的一類藥。國家

2、藥監(jiān)局已批準上市的中藥類有:地榆升白片、復方皂礬丸、升白合劑等十余種。因其各有弊端使它們在臨床的應用中受到局限。
　　 錦囊升白沖劑系齊錦生教授多年臨床隨訪觀察經(jīng)驗總結(jié)，療效顯著，總有效率可達94％。是耐受放、化療治療極具臨床開發(fā)前景的升白細胞新藥。
　　 骨髓抑制后再生的細胞基礎是造血干細胞(Hematopoieticstemcell，HSC)，HSC通過不斷的自我更新，不僅維持自身數(shù)量的恒定，且通過分化成各系祖細胞滿

3、足外周血造血需求。近年來研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)在因素對HSC自我更新具有強大的調(diào)控能力，如經(jīng)典的WNT信號途徑、NOTCH信號途徑、同源盒(HOX)轉(zhuǎn)錄因子家族等可以調(diào)控HSC的自我更新能力。目前認為，NOTCH和WNT信號通路之間存在相互聯(lián)系和協(xié)調(diào)平衡，WNT信號通路的高度活化是造血祖細胞增殖的重要條件，NOTCH通路對于維持造血祖細胞的未分化狀態(tài)和休眠是必須的。HOX基因是同源盒基因(homeoboxgene)家族中的一員，是一類在進化上高

4、度保守的基因，HOX基因不僅調(diào)控正常造血增殖分化過程，其異常表達與白血病密切相關。此外一些小分子介質(zhì)，如前列腺素E2(PGE2)，在調(diào)節(jié)HSC自我更新上起著重要化學調(diào)節(jié)作用，PGE2和WNT信號通路相互作用，通過活化WNT信號通路促進HSC的自我更新。
　　 在錦囊升白沖劑安全有效的臨床應用基礎上，本研究通過檢測大量受輻射后白細胞減少的小鼠飲用錦囊升白沖劑后，外周血白細胞的變化，證明其有顯著升高白細胞作用后;采用PCR和West

5、ernblotting技術(shù)篩查各組小鼠骨髓單個核細胞調(diào)節(jié)造血信號通路的基因:β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA水平和蛋白含量的變化，以探求白細胞減少癥模型小鼠飲用錦囊升白沖劑后外周血白細胞升高的機制。本實驗還應用PGE2合成酶COX2的特異性抑制劑celecoxib(塞來昔布)，通過抑制PGE2的合成，以探求錦囊升白沖劑在促進小鼠造血功能恢復過程中，是否是通過PGE2作用于WNT信號通路而發(fā)

6、揮主要作用。
　　 為了進一步探求錦囊升白組方的有效成份亦或存在起效的單體成份，對該組方進行了分離純化，這對闡明該藥物作用分子機制和開發(fā)有重要意義。
　　 第一部分.錦囊升白沖劑對放化療后骨髓抑制再生的分子機制研究方法:
　　 1.動物分組與取材
　　 健康雄性小鼠(20±5g)140只，昆明種，隨機分為五組:地榆升白組、錦囊升白組、塞來昔布+錦囊升白組（塞+錦組）、病理對照組、正常對照組。正常對照組小鼠

7、20只，余四組每組30只。前四組共120只小鼠（1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，直線加速器X線照射小鼠后肢雙側(cè)股骨，距離100cm，總劑量為4Gy，照射后1天檢測白細胞，白細胞降至5×109.L-1以下為造模成功），造模成功后小鼠80只，每組20只。以上五組正常飲食喂養(yǎng)，病理對照組和正常對照組自由飲水，前三組（地榆升白組給予地榆升白片、錦囊升白組給予錦囊升白沖劑、塞+錦組給予錦囊升白沖劑+塞來昔布膠囊）按人與動物單位體重折算的等效劑量計算小鼠

8、的每日用藥量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相應濃度的藥液給小鼠飲用，連續(xù)給藥8天。
　　 2.小鼠外周血細胞的檢測和血清中PGE2值檢測
　　 小鼠在室溫20-25℃下喂養(yǎng)，給藥第4天、第8天，每組取20只小鼠以內(nèi)眥取血法采集小鼠抗凝血20μl，用血細胞分析器檢測外周血細胞數(shù)值，同時在給藥第8天每組取20只小鼠以內(nèi)眥取血法，每只小鼠采抗凝血200μl，室溫自然凝固后取血清測PGE2值。
　　 3.骨髓單個核細

9、胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的轉(zhuǎn)錄水平的檢測
　　 實驗結(jié)束后頸椎脫臼分組處死小鼠后，用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，收集細胞后用于提取總RNA和蛋白用于PCR和Westernblotting等分子生物學檢測。Trizol法提取骨髓單個核細胞中總RNA，用β-actin做內(nèi)參，PCR法檢測β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA表達。

10、　　 4.骨髓單個核細胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量
　　 用Lowry法測定蛋白含量，Westernblotting檢測骨髓中β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量。
　　 隨后對錦囊升白組方進行進一步分離純化，再用各分離純化得到的組分給造模成功后的小鼠飲用，觀察各組分的有效性，從而尋求該中藥組方的有效作用部位。并用分離純化后得到的有效組份進行二極管陣

11、列檢測器和蒸發(fā)光檢測器檢測，通過定性分析以求明確其有效成份。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠的一般表現(xiàn)，錦囊升白沖劑對小鼠外周血白細胞和狀態(tài)的影響
　　 給藥第4天，地榆升白組（6.8±2.84）、錦囊升白組(5.47±1.79)較病理對照組(4.82±2.11)外周血白細胞數(shù)顯著升高(P＜0.05）。錦囊升白組較地榆升白組小鼠活動性強，被毛順滑更有光澤。塞+錦組(3.85±0.79)與病理對照組(4.82±2.1

12、1)相比白細胞計數(shù)無統(tǒng)計學差異。塞+錦組(3.85±0.79)和病理對照組一般狀態(tài)最差，動物開始活動減少，精神萎靡，閉目，尾、耳顏色蒼白，被毛粗亂、蓬松且無光澤，體重隨飲食量減少而下降。給藥第8天地榆升白組（8.0±3.01）、錦囊升白組(7.99±2.75)較病理對照組(4.74±2.36)外周血白細胞數(shù)有顯著差異(P＜0.05)。塞+錦組(3.77±1.74)與病理對照組(4.74±2.36)相比白細胞計數(shù)無統(tǒng)計學差異。
　　

13、 2.小鼠血清PGE2濃度檢測
　　 ELISA法檢測小鼠血清PGE2濃度結(jié)果:錦囊升白組、地榆升白組和病理對照組相比PGE2濃度明顯增高(P＜0.05）。塞+錦組與病理對照組無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 3.骨髓單個核細胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2轉(zhuǎn)錄水平的變化
　　 地榆升白組COX2的mRNA表達(0.1194±0.00795)和錦囊升白組COX2的mRNA表達(0

14、.0953±0.01274)相對病理對照組(0.0377±0.00564)均明顯增高。錦囊升白組的JAGGED1mRNA表達(0.2628±0.01855)相對病理對照組(0.0429±0.00704)明顯增高。錦囊升白組β-Catenin的mRNA表達(0.3935±0.12128)相對病理對照組(0.423±0.0186)，無明顯統(tǒng)計學差異。錦囊升白組HOXB4的mRNA表達(0.0795±0.01407)相對正常對照組(0.075

15、7±0.0135)，無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 4.骨髓單個核細胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2蛋白含量的變化
　　 地榆升白組COX2的蛋白表達(0.7963±0.099)和錦囊升白組COX2的蛋白表達(0.7074±0.0842)相對病理對照組(0.2697±0.0324)有顯著差異(P＜0.01)。錦囊升白組(0.4901±0.0308)、塞+錦組(0.2433±0.0129)的JAGGED

16、1的蛋白表達相對病理對照組(0.1017±0.0078)有顯著差異(P＜0.01)。地榆升白組的β-Catenin蛋白表達(0.8366±0.1143)和錦囊升白組β-Catenin的蛋白表達(0.4268±0.0352)相對病理對照組(0.0979±0.0151)，有顯著差異(P＜0.01）。錦囊升白組的HOXB4蛋白表達(0.203±0.013)相對正常對照組(0.2249±0.0193)無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 第二部分.

17、錦囊升白組方有效成份的分離方法:
　　 1.錦囊升白組方有效成份的分離、純化
　　 中藥水煎后水相部分加有機溶劑萃取，藥渣部分用適量95％乙醇浸泡24小時后藥液倒出留用，藥渣部分再用同等量95％乙醇浸泡10小時，兩次的藥液為乙醇相，乙醇相60-65℃懸蒸濃縮2小時，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末。有機溶劑萃取:第一步:加常壓下沸程為60-90℃石油醚萃取兩次，石油醚相40-45℃懸蒸濃縮2小時，再用水浴鍋

18、干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末。第二步:石油醚萃取后水相部分加沸點為61℃的氯仿萃取兩次，氯仿相40-45℃懸蒸濃縮2小時，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末。第三步:氯仿萃取后水相部分加乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯相40-45℃懸蒸濃縮2小時，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末。第四步:乙酸乙酯萃取后水相部分用正丁醇萃取兩次，正丁醇相70-78℃懸蒸濃縮2小時，再用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末

19、。正丁醇萃取后水相部分用水浴鍋干燥后放入烤箱80℃進一步干燥為粉末。
　　 2.實驗動物和分組
　　 健康雄性小鼠(20±5g)230只，昆明種，隨機分為八組:石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水相組、乙醇組、病理對照組、正常對照組。正常對照組每組20只，余七組每組30只。前七組共210只小鼠(1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，直線加速器放射源照射小鼠后肢雙側(cè)股骨，距離100cm，總劑量為4Gy，照射后1天檢測白細胞，白細

20、胞降至5×109.L-1以下為造模成功）。造模成功后前七組每組選取小鼠20只，以上八組正常飲食喂養(yǎng)，病理對照組和正常對照組自由飲水，前六組（石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水相組、乙醇組）按人與動物單位體重折算的等效劑量計算小鼠的用藥量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相應濃度的藥液給小鼠飲用，連續(xù)給藥8天。
　　 3.小鼠外周血細胞的檢測
　　 給藥第8天每組取20只小鼠采內(nèi)眥靜脈抗凝血20μl，用血細胞自動計

21、數(shù)儀檢測外周血細胞變化。
　　 4液相色譜檢測器檢測已分離物質(zhì)
　　 取氯仿相、乙酸乙酯相、水相組三相物質(zhì)用二極管陣列檢測器檢測是否存在紫外吸收的化合物，用蒸發(fā)光檢測器檢測沒有紫外吸收的有機物質(zhì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠的一般表現(xiàn)，錦囊升白組方各分離成份對小鼠外周血白細胞和狀態(tài)的影響
　　 給藥第8天，氯仿組(11.97±4.65)、乙酸乙酯組(12.44±5.13)、水相組(17.39±6

22、.38)較病理對照組(4.27±2.12)外周血白細胞數(shù)上升差值顯著升高(P＜0.05）。氯仿組、乙酸乙酯組、水相組較病理對照組小鼠活動性強，被毛順滑更有光澤。石油醚組(6.61±1.96)、正丁醇組(5.29±1.79)、乙醇初提組(7.2±2.78)與病理對照組(4.27±2.12)相比白細胞計數(shù)無統(tǒng)計學差異，這幾組動物開始活動減少，精神萎靡，閉目，尾、耳顏色蒼白，被毛粗亂、蓬松且無光澤，體重隨飲食量減少而下降。
　　 2.

23、藥物分離純化后成分的定性分析
　　 二極管陣列檢測器（選200-400波長）檢測表明:氯仿、乙酸乙酯、水相三個組無明顯區(qū)別，波型類似，不存在紫外吸收物質(zhì)。蒸發(fā)光檢測器515X2(alteeh)檢測不揮發(fā)分子，確定不存在紫外吸收物質(zhì)（多糖無紫外吸收）;醇沉為5000以上大分子，沉的不多，其大部分物質(zhì)為5000以下的小分子量多糖。
　　 結(jié)論:
　　 1.錦囊升白沖劑使骨髓抑制后的小鼠外周血白細胞數(shù)顯著升高。