擬南芥NADPH氧化酶介導(dǎo)動態(tài)活性氧的水平從而調(diào)控絨氈層程序性細(xì)胞死亡及花粉發(fā)育的研究.pdf

1、程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)是動植物中普遍存在的重要生物學(xué)現(xiàn)象，它是指細(xì)胞自主進(jìn)行的受基因編碼調(diào)控的自我降解和消亡的過程。高等植物的小孢子母細(xì)胞要發(fā)育成有功能的花粉，需要花藥絨氈層細(xì)胞進(jìn)行PCD，為花粉的發(fā)育提供蛋白質(zhì)、脂類、孢粉素等營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)絨氈層細(xì)胞不能進(jìn)行正常的PCD時，會造成花粉敗育，導(dǎo)致植物雄性不育。已有研究表明活性氧(Reactive OxygenSpecies，ROS)參與了絨氈層

2、PCD過程，當(dāng)水稻花藥中的ROS不能被清除時，會導(dǎo)致絨氈層PCD提前。研究ROS調(diào)控花藥絨氈層PCD的分子機(jī)制，對揭示程序性細(xì)胞死亡的分子機(jī)理具有重要的研究價值，進(jìn)而可以通過生物工程技術(shù)直接控制花藥中ROS的含量創(chuàng)建雄性不育系，用于培育雜種優(yōu)勢植物。
　　前人的研究表明DYT1、TDF1、AMS、MYB80等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，級聯(lián)調(diào)控擬南芥花藥絨氈層PCD過程。這些轉(zhuǎn)錄因子分別發(fā)生功能缺失突變，都會導(dǎo)致植物雄性不育，如突變體dyt1、

3、tdf1、ams的絨氈層PCD延遲，突變體myb80的絨氈層PCD提前。我們發(fā)現(xiàn)一個功能未知的基因RBOHE(Respiratory Burst Oxidase Homolog E)，在擬南芥花藥第6-11期高水平表達(dá)。RBOHE編碼一個NADPH氧化酶，在動植物中功能已知的NADPH氧化酶可以氧化NADPH產(chǎn)生ROS，調(diào)控多種生物學(xué)過程。而過多的ROS會損傷DNA、蛋白質(zhì)和質(zhì)膜，引起程序性細(xì)胞死亡。我們通過對已公開發(fā)表的花藥轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)

4、據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RBOHE在絨氈層PCD延遲突變體dyt1、tdf1、ams中表達(dá)量顯著降低，而在絨氈層PCD提前突變體myb80（ms188-1）中表達(dá)量明顯升高。我們推測RBOHE基因很可能受DYT1、TDF1、AMS、MYB80等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，在花藥絨氈層細(xì)胞中時空特異性表達(dá)產(chǎn)生ROS調(diào)控絨氈PCD。本實驗的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)RBOHE基因在花藥絨氈層細(xì)胞中時空特異性表達(dá)
　　通過RNA原位雜交和啟動

5、子連接報告基因?qū)嶒炑芯苛薘BOHE的表達(dá)模式，結(jié)果顯示:隨著花藥的發(fā)育，RBOHE在花藥絨氈層細(xì)胞中時空特異性表達(dá)，在花藥第6-7期，RBOHE開始表達(dá)，并且表達(dá)量逐漸升高;在花藥第8-9期，RBOHE的表達(dá)量達(dá)到峰值;在花藥第10-11期，RBOHE的表達(dá)量逐漸降低，最終隨著絨氈層細(xì)胞的降解而消失。這說明RBOHE確實在絨氈層中時空特異性表達(dá)。
　　(2)RBOHE基因的功能缺失突變和過量表達(dá)都會干擾絨氈層PCD進(jìn)程。
　

6、　通過反向遺傳學(xué)對擬南芥RBOHE基因的功能缺失突變體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:rbohe突變體果莢結(jié)實率較野生型下降約20％，rbohe突變體花粉敗育率約為50％?；ㄋ帢渲衅屯干潆婄R結(jié)果顯示:rbohe突變體的花藥絨氈層降解較野生型明顯推遲。原位末端凋亡檢測結(jié)果顯示:rbohe突變體的花藥絨氈層PCD起始時間較野生型亦明顯推遲。
　　在野生型擬南芥中，用花藥絨氈層特異的啟動子驅(qū)動過量表達(dá)RBOHE，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株花藥絨氈層PCD提

7、前，花粉敗育。這說明RBOHE基因在花藥絨氈層細(xì)胞中的表達(dá)量需被嚴(yán)格控制，否則會影響絨氈層PCD進(jìn)程和花粉發(fā)育。
　　(3)RBOHE和RBOHC基因在絨氈層PCD過程中功能冗余
　　通過RNA原位雜交和啟動子連接報告基因?qū)嶒炑芯苛薘BOHC的表達(dá)模式，結(jié)果顯示:RBOHC在花藥絨氈層細(xì)胞中的表達(dá)時期與RBOHE相似，但表達(dá)量顯著低于RBOHE。掃描電鏡結(jié)果顯示:rbohe/rbohc雙突變體花粉敗育率約60％，較rbohe

8、單突變體顯著升高。樹脂切片和原位末端凋亡實驗顯示:rbohe/rbohc雙突變體的絨氈層降解較rbohe單突變體亦明顯推遲。這說明RBOHE和RBOHC基因在絨氈層降解過程中功能冗余，共同調(diào)控擬南芥花藥絨氈層PCD進(jìn)程和花粉發(fā)育。
　　(4)NADPH氧化酶通過產(chǎn)生ROS調(diào)控絨氈層PCD進(jìn)程
　　通過NBT染色和H2DCF-DA熒光染色實驗檢測擬南芥花藥中ROS的動態(tài)變化，結(jié)果顯示:在野生型中，隨著花藥的發(fā)育，ROS的量呈現(xiàn)

9、動態(tài)變化，在花藥第6-7期，ROS的量開始升高，在花藥第8-9期，ROS的量達(dá)到峰值，在花藥第10-11期，ROS的量逐漸降低。ROS在花藥中的動態(tài)變化與RBOHE和RBOHC在花藥中的表達(dá)模式相對應(yīng)。并且在rbohe單突變體和rbohe/rbohc雙突變體的花藥中，ROS的量較野生型明顯降低，rbohe/rbohc雙突變體中ROS的量較rbohe單突變體亦明顯降低。在過量表達(dá)RBOHE的轉(zhuǎn)基因植株中，ROS的量在花藥第6-7期出現(xiàn)峰值

10、，到花藥第8期，ROS的量開始降低。這說明RBOHE和RBOHC通過產(chǎn)生ROS調(diào)控絨氈層PCD進(jìn)程。
　　(5)RBOHE基因分別受絨氈層中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AMS正調(diào)控和MYB80負(fù)調(diào)控
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示:在ams突變體的花藥中，RBOHE的表達(dá)量降低60倍;在ms188-1(myb80)突變體的花藥中，RBOHE的表達(dá)量升高到2.5倍。通過RNA原位雜交和啟動子連接報告基因?qū)嶒灧謩e檢測RBOHE在ams和ms188-

11、1突變體中的表達(dá)量，結(jié)果顯示:在ams突變體的絨氈層細(xì)胞中，幾乎檢測不到RBOHE信號;在myb80突變體的絨氈層細(xì)胞中，則檢測到較野生型中更強(qiáng)的RBOHE信號。通過構(gòu)建rbohe/myb80雙突變體并對其表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:rbohe/myb80雙突變體可以部分恢復(fù)myb80單突變體絨氈層PCD提前的表型。這說明RBOHE在絨氈層細(xì)胞中時空特異性表達(dá)受絨氈層PCD過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。
　　綜上所述，擬南芥RBOHE基因