TNF-α誘導(dǎo)肝細胞胰島素抵抗的機制研究：NADPH氧化酶3源性活性氧的作用.pdf

1、目的：氧化應(yīng)激在胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生中起著重要的作用。本研究旨在建立SD大鼠和肝細胞HepG2的胰島素抵抗模型。觀察喂養(yǎng)高脂飼料的SD大鼠肝臟中氧化應(yīng)激以及胰島素抵抗的發(fā)生。在體外應(yīng)用TNF-α誘導(dǎo)的HepG2細胞胰島素抵抗模型，分析胰島素抵抗狀態(tài)下活性氧（ROS）的變化，明確ROS的主要來源，研究TNF-α誘導(dǎo)肝細胞胰島素抵抗的機制，側(cè)重探討NADPH氧化酶3（NOX3）在TNF-α誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗中的作用。
　　

2、 方法：以高脂飼料喂養(yǎng)6只4周齡雄性SD大鼠12周，建立大鼠胰島素抵抗模型。用優(yōu)越血糖儀以電子感應(yīng)法測定血糖，放射免疫法檢測血清胰島素水平，ELISA測定血清TNF-α濃度。RT-PCR分析肝臟組織中NOX3、P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl的表達，DHE染色觀察肝臟組織中的ROS水平。在體外選用HepG2細胞，用TNF-α（4ng/ml）刺激細胞4d，建立胰島素抵抗細胞模型。蒽酮法測定培養(yǎng)細胞內(nèi)糖原水平；用RT

3、-PCR分析TNF-α刺激前后NADPH氧化酶（NOX）家族及其亞組分的表達譜變化；以DCFH-DA探針標記與流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平；應(yīng)用免疫熒光和Western blot觀察P47 PHOX的膜移位；設(shè)計合成針對NOX3的小分子RNA（NOX3-siRNA），將其瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞以干擾NOX3基因的表達；用Western blot檢測NOX3及其亞組分如P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl的表達以及胰

4、島素信號通路中JNK、p-JNK、IRSl、p-IRSl、AKT、p-AKT、GSK和p-GSK水平。
　　 結(jié)果：以高脂飼料喂養(yǎng)12周后，大鼠空腹血糖水平略有上升，但與對照組的大鼠相比無顯著差異。而胰島素敏感指數(shù)降低，血清TNF-α水平顯著升高。蒽酮法的檢測結(jié)果顯示高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝組織糖原含量顯著降低，表明肝組織發(fā)生了胰島素抵抗。在胰島素抵抗狀態(tài)下，大鼠肝組織中NOX3的表達顯著增加，DHE染色顯示肝組織ROS水平顯著增加，

5、提示ROS在肝胰島素抵抗發(fā)生中起重要作用。在體外實驗中，細胞內(nèi)糖原水平的檢測結(jié)果顯示，TNF-π處理后HepG2細胞內(nèi)糖原合成量顯著降低，表明TNF-α誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生了胰島素抵抗。TNF-α刺激HepG2細胞導(dǎo)致ROS水平呈濃度和時間依賴性增加。分別用ROS產(chǎn)生途徑的抑制劑如NOX抑制劑DPI、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體抑制劑Rotenone、一氧化氮合酶抑制劑L-NAME和黃嘌呤氧化酶抑制劑Oxypurinol預(yù)處理HepG2后，再

6、分別用TNF-α（4 ng/ml）刺激，結(jié)果顯示DPI顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，而其它抑制劑處理組的ROS水平無顯著性變化。提示NOX是TNF-α誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生ROS的主要來源。RT-PCR結(jié)果顯示，HepG2細胞中主要表達NOX3及亞組分P22PHOX、P47PHOX、P67PHOX和Racl。進一步應(yīng)用Western blot分析NOX亞組分的表達變化，結(jié)果表明TNF-α處理后亞組分P22PHOX、P47PHOX、

7、P67PHOX和Racl的表達無明顯變化，而Real-time PCR和Western blot的結(jié)果顯示，TNF-α刺激后的NOX3的表達顯著升高。觀察TNF-α對NOX3活性的調(diào)節(jié)機理的結(jié)果表明，用PKC激動劑PMA預(yù)處理可引起TNF-α誘導(dǎo)的ROS水平進一步升高，而PKC抑制劑Hypericin能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。培養(yǎng)的HepG2細胞中P47PHOX主要分布在胞漿，而TNF-α處理后P4PHOX發(fā)生明顯的膜移位。P

8、47 PHOX抑制劑Apocynin能顯著抑制TNF-α刺激的P47PHOX膜轉(zhuǎn)位，并且能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的ROS水平，表明TNF-α通過PKC途徑和P47PHOX的膜移位來調(diào)節(jié)NOX3活性。為了確定NOX3源性ROS在TNF-α誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生胰島素抵抗中的作用，我們將NOX3-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，獲得低表達NOX3水平的HepG2細胞。分析ROS水平與胰島素抵抗狀態(tài)的結(jié)果顯示，抑制NOX3基因表達后可下調(diào)TNF

9、-α引起的氧化應(yīng)激水平，并促進糖原的合成，改善胰島素抵抗狀態(tài)。說明NOX3參與了TNF-α引起的ROS的生成和胰島素抵抗。在此基礎(chǔ)上，我們進一步探討TNF-α誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生胰島素抵抗的機制。結(jié)果顯示，4 ng/ml TNF-α處理HepG2細胞后，伴隨NOX3表達與ROS水平的升高，磷酸化的JNK和IRSl的307-Ser磷酸化水平增多，而IRSl的表達顯著下調(diào)，胰島素信號通路中AKT和GSK的磷酸化水平也下降。應(yīng)用JNK抑制劑

10、SP600125處理HepG2能抑制TNF-α的作用，引起JNK和IRS1307-Ser磷酸化水平下調(diào)，并提高AKT和GSK的磷酸化水平。干擾NOX3基因的表達也可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對胰島素信號通路的影響，促進肝細胞內(nèi)糖原的合成。這些結(jié)果表明，TNF-α通過NOX3介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，其機理涉及到INK/IRSl/PI-3K/AKT信號通路。
　　 結(jié)論：
　　 1.高脂飼料喂養(yǎng)12周的SD大鼠

11、血清TNF-α水平顯著升高，胰島素敏感指數(shù)降低，肝組織中NOX3表達和ROS水平顯著增加，糖原含量顯著降低；
　　 2.TNF-α主要通過上調(diào)NOX3的表達和活性顯著提高HepG2細胞的ROS水平；
　　 3.NOX3的激活主要通過PKC途徑和P47PHOX的膜轉(zhuǎn)位；
　　 4.TNF-α可誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生胰島素抵抗，其作用機制為：TNF-α可激活JNK信號通路，增加IRSl的307位Scr磷酸化水平，下調(diào)