篩選與CVB3 VP3蛋白相互作用的人細(xì)胞蛋白.pdf

1、目的:
　　從人心臟cDNA文庫中篩選出與CVB3 VP3蛋白相互作用的人細(xì)胞蛋白。
　　方法:
　　1.采用PCR技術(shù)擴增出VP3基因,將其插入到真核表達質(zhì)粒pGBKT7中構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3;
　　2.采用乙酸鋰法將pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109中,通過表型鑒定、PCR法驗證質(zhì)粒pGBKT7-VP3是否轉(zhuǎn)化至酵母菌中;
　　3.利用Western blot檢測酵母菌AH109

2、[pGBKT7-VP3]中VP3蛋白的表達;
　　4.利用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基以及酶底物X-α-Gal的變化情況檢測VP3基因?qū)蟾婊?HIS3、ADE2和MEL1)的轉(zhuǎn)錄自激活作用;
　　5.經(jīng)小規(guī)模配合試驗檢測VP3蛋白對酵母菌配合功能的影響;
　　6.利用大規(guī)模酵母配合實驗篩選人心臟cDNA文庫;
　　7.經(jīng)陽性克隆的表型確定、PCR擴增cDNA插入片段和Alu I酶切等試驗將陽性克隆歸類,并進行測序和同源性比

3、對分析;
　　8.采用α-半乳糖苷酶定量分析VP3蛋白與各陽性蛋白之間相互作用的強弱;
　　9.利用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基以及酶底物X-α-Gal的變化情況檢測陽性文庫質(zhì)粒pGADT7-ADx對報告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的轉(zhuǎn)錄自激活作用;
　　10.利用回返配合試驗對篩出的各陽性蛋白與VP3蛋白的相互作用再次進行驗證。
　　結(jié)果:
　　1.雙酶切及序列分析提示VP3基因已成功插入pGBKT7載體的多克

4、隆位點,并且閱讀框與病毒VP3基因一致;
　　2.表型鑒定和PCR法驗證pGBKT7-VP3質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中;
　　3. Western blot證實酵母菌AH109[pGBKT7-VP3]能表達VP3蛋白;
　　4.營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal變化情況顯示VP3蛋白對報告基因無轉(zhuǎn)錄自激活作用;
　　5.小規(guī)模配合試驗表明VP3蛋白在AH109的表達基本不影響酵母菌正常的配合功能。

5、>　　6.以CVB3 VP3為誘餌蛋白,從人心臟cDNA文庫中篩選到50個陽性候選克隆;
　　7.經(jīng)陽性候選克隆的初步分析將陽性克隆歸為10類,并經(jīng)測序和同源性比對,最后共獲得10種不同類別的陽性蛋白:線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間室蛋白1( ERGIC1)、真核翻譯起始因子4A2(EIF4A2)、肌鈣蛋白I3型(TNNI3)、平滑肌蛋白3(LMOD3)、羥酰輔酶 A脫氫酶三官能蛋白轉(zhuǎn)錄變體3( HADHB

6、)、門冬酰胺酶同系物(ASPG)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、肌肉型肌酸激酶(CKM)、骨骼肌α1肌動蛋白(ACTA1)。
　　8.α-半乳糖苷酶定量試驗進一步證明了篩選出的10種陽性蛋白與VP3蛋白均有較強的相互作用;
　　9.篩選出的10種陽性蛋白對報告基因無轉(zhuǎn)錄自激活作用;
　　10.回返配合試驗再次驗證10種陽性蛋白與VP3蛋白存在相互作用。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGBKT