不同鋅源對(duì)豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因水平的影響.pdf

1、本試驗(yàn)以豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯苛巳N鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）對(duì)IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因水平的影響。并通過RNA干擾，研究ZIP4在腸道鋅轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步探討氨基酸螯合鋅在豬腸道的可能吸收模式。試驗(yàn)分以下兩部分進(jìn)行:
　　試驗(yàn)一 不同鋅源和鋅水平對(duì)IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響
　　1.不同鋅源對(duì)豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1細(xì)胞增殖的影響
　　試驗(yàn)以IPEC-1為研究對(duì)

2、象，分別在IPEC-1細(xì)胞培養(yǎng)液中添加鋅濃度為0、50、100、150、200μmol/L的三種鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）分別培養(yǎng)6h、12h、24 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖變化。結(jié)果表明:在作用6h、12h或24 h后，高劑量的三種鋅源均顯著抑制豬腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05），其中以6h時(shí)細(xì)胞活性值的下降幅度最小，但高劑量（100μmol/L以上）同濃度的有機(jī)鋅對(duì)IPEC-1細(xì)胞的損傷小于無機(jī)鋅。同時(shí)甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫

3、酸鋅組IPEC-1細(xì)胞活性具有明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著鋅濃度的增加細(xì)胞活性下降，并且在鋅添加水平≥100μmnol/L時(shí)下降明顯。因此本試驗(yàn)選擇50μmol/L、6h作為最佳處理濃度和時(shí)間用于后期試驗(yàn)。
　　2.不同鋅源對(duì)豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因水平的影響
　　選用鋅濃度為50μmol/L的三種鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）或鋅濃度為0、50、100、200μmol/L的甘氨酸鋅分別作用于IPEC-1細(xì)

4、胞，處理6h。Real-time PCR法測(cè)定MT1、DMT1、ZIP4、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表達(dá)水平，以β-actin mRNA水平作為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果表明:三種鋅源均可快速有效改善細(xì)胞鋅狀態(tài)。添加鋅可顯著上調(diào)IPEC-1細(xì)胞MT1、ZIP5、ZnT1和ZnT2 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），下調(diào)ZIP4 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)，但三種鋅源處理組組間差異顯著。與對(duì)照組相比，甘氨酸鋅組能較顯著地上調(diào)MT1、

5、DMT1、ZnT1mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）;硫酸鋅和蛋氨酸鋅組ZnT2 mRNA表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），DMT1、ZIP4 mRNA表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）;硫酸鋅組ZIP5 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)，其他各組差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)添加不同水平的甘氨酸鋅處理IPEC-1細(xì)胞6h后，MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)，ZIP4 mRNA表達(dá)水平

6、顯著下降（P＜0.05）。添加鋅濃度為50μmol/L的甘氨酸鋅可顯著增加DMT1 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），而高濃度鋅添加量（100、200μmol/L）均顯著降低其表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　試驗(yàn)二 ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)IPEC-1 MT1、DMT1 mRNA表達(dá)及細(xì)胞鋅吸收率的影響
　　以豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)合成針對(duì)ZIP4基因的siRNA，經(jīng)LipofectamineTM2000

7、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染IPEC-1細(xì)胞24 h、48 h，RT-PCR法檢測(cè)ZIP4mRNA水平表達(dá)的變化，并用MTT法檢測(cè)IPEC-1細(xì)胞增殖的變化;添加50μmol/L硫酸鋅、甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅分別處理ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6h，RT-PCR法檢測(cè)MT1、DMT1 mRNA表達(dá)變化，ICP-MS法檢測(cè)IPEC-1細(xì)胞鋅吸收率的變化。研究結(jié)果表明:
　　(1)4對(duì)ZIP4-siRNA序列轉(zhuǎn)染IPEC-1細(xì)胞24 h或48 h可有效抑制

8、ZIP4 mRNA表達(dá)，其中ZIP4-siRNA1序列抑制效果更明顯。與空白對(duì)照組相比，24 hZIP4-siRNA1抑制率達(dá)到64.60％;48 h干擾效果更加突出，抑制率達(dá)到78.43％。同時(shí)MTT結(jié)果顯示，ZIP4-siRNA1轉(zhuǎn)染IPEC-1細(xì)胞24 h或48 h對(duì)細(xì)胞MTT OD值無顯著影響（P＞0.05）。因此，本試驗(yàn)選取ZIP4-siRNA1和24 h分別作為最佳特異性RNA干擾序列和干擾時(shí)間。
　　(2)不同鋅源作

9、用IPEC-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞6h發(fā)現(xiàn):添加硫酸鋅和甘氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組MT1 mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組分別下降了16.94％(P＜0.05)、33.62％（P＜0.05），但添加蛋氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組MT1 mRNA表達(dá)水平與陰性對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。與陰性對(duì)照組相比，添加硫酸鋅的轉(zhuǎn)染組DMT1 mRNA表達(dá)水平提高了29.61％（P＞0.05），而添加甘氨酸鋅和蛋氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組DMT1 mRNA表達(dá)水平分別下降了29.85％(P＜0.

10、05)、26.44％(P＜0.05)。添加硫酸鋅作用6h后，ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染組IPEC-1細(xì)胞鋅吸收率較陰性對(duì)照組下降了73.33％（P＜0.05），但ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染前后對(duì)甘氨酸鋅和蛋氨酸鋅組細(xì)胞鋅吸收率影響不顯著（P＞0.05）。
　　綜上所述，添加甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅或硫酸鋅均可快速有效改善細(xì)胞鋅狀態(tài);高劑量的三種鋅源均可抑制豬腸上皮細(xì)胞增殖，但高劑量（鋅濃度≥100μmol/L）同濃度的有機(jī)鋅對(duì)豬腸上皮細(xì)胞的

11、損傷小于無機(jī)鋅;三種鋅源對(duì)腸道鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)存在差異，甘氨酸鋅組能夠較顯著地上調(diào)MT1、DMT1、ZnT1mRNA表達(dá)水平，硫酸鋅和蛋氨酸鋅組ZnT2 mRNA表達(dá)水平顯著增加，DMT1、ZIP4 mRNA表達(dá)均顯著下降，硫酸鋅組ZIP5 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他各組。添加不同水平的甘氨酸鋅可顯著上調(diào)MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)ZIP4 mRNA表達(dá)水平。RNAi實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)硫酸鋅在腸道的