元胡止痛方主活性成分分析及其藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、中藥是重要的天然藥物，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下用于治療疾病的藥物，而中醫(yī)臨床治病常用復(fù)方。每一味中藥即是一個(gè)小的化學(xué)成分庫，可見中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性。復(fù)雜的化學(xué)組成使得現(xiàn)代科學(xué)很難揭示中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時(shí)，由于受到藥用生物的個(gè)體差異性、天然礦物的不均一性等諸多因素影響，同種中藥不同產(chǎn)地或不同采收季節(jié)所含成分差別很大。加之中藥制劑工藝的粗糙性，中藥的質(zhì)量很難做到始終如一，進(jìn)一步導(dǎo)致中藥的療效亦很難做到始終如一。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚

2、，質(zhì)量可控性低已成為制約中藥發(fā)展的瓶頸問題。
　　任何藥物發(fā)揮藥效都是通過與人體相互作用完成的。人體服用中藥后，血液中一定存在源自中藥的原型成分，或體內(nèi)代謝及應(yīng)激產(chǎn)物，這些成分可能是具有藥理作用的活性成分，若對(duì)病證的主癥產(chǎn)生顯著治療作用，則稱為有效成分。因此，中藥血清藥物化學(xué)作為一種研究中藥的新手段，已成為篩選中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)十分有效的工具。另外，中藥的藥效往往是多成分和多靶點(diǎn)的協(xié)同作用結(jié)果，單一成分或單靶點(diǎn)效應(yīng)的情況較為少見。而

3、藥代動(dòng)力學(xué)研究在判斷聯(lián)合用藥時(shí)不同藥物之間的相互作用方面有著不可替代的作用，對(duì)中藥復(fù)方組方原理研究意義重大。
　　本研究以中醫(yī)臨床常用的元胡止痛方為研究對(duì)象，從其組方藥物入手，運(yùn)用血清藥物化學(xué)分析和動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)等研究手段，旨在探討和闡明元胡止痛方的主活性成分及其在體內(nèi)代謝和組織分布規(guī)律，為揭示元胡止痛方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和組方原理奠定基礎(chǔ)。
　　1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　1.1建立元胡止痛方組方藥物延胡索、白芷的有效組分延胡索總生

4、物堿、白芷總香豆素在大鼠體內(nèi)外成分分析方法，確證該方的主活性成分。
　　1.2建立延胡索乙素、歐前胡素在大鼠血漿和組織中的分析方法，考察其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和組織分布特性。
　　1.3初步闡釋歐前胡素對(duì)延胡索乙素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)特性的影響。
　　2實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1延胡索主活性成分研究
　　2.1.1延胡索總生物堿提取和成分分析及其含量測(cè)定
　　2.1.1.1延胡索總生物堿提取方法按照《中國藥典》

5、（2010年版一部）收載的“元胡止痛軟膠囊”的制劑方法，制備延胡索藥材提取物；然后，利用生物堿異溶于酸水而難溶于堿水的特點(diǎn)提取延胡索藥材提取物中的總生物堿。
　　2.1.1.2延胡索總生物堿成分分析方法采用HPLC法分析延胡索總生物堿提取物的化學(xué)成分。色譜條件：色譜柱：Phenomenex Luna-C18 column(250×4.6 mm，5.0μm)；流動(dòng)相：乙腈（A）、0.1％磷酸水溶液（三乙胺調(diào)至pH5.7，B）；梯度洗

6、脫程序：0～15min，20％A；15～30 min，20～25％A；30～50 min，25～80％A；50～60 min，80％A；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量：10μL。
　　2.1.2延胡索總生物堿提取物大鼠體內(nèi)成分定性分析
　　2.1.2.1大鼠血漿樣品制備方法大鼠灌胃給予延胡索總生物堿提取物0.5 h后，通過大鼠肝門靜脈取血約1 mL于肝素抗凝管中抗凝，3500 r/min

7、離心10 min后即得血漿樣品。
　　2.1.2.2大鼠血漿樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確吸取大鼠血漿500μL于具塞玻璃離心管中，加入堿化試劑（NaOH；1 mol/L）100μL，混勻；加入3 mL氯仿萃取液，于渦旋混合器上混勻5 min，3500 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，合并兩次萃取液于潔凈的玻璃離心管中，置于氮吹儀中40℃吹干即得待測(cè)樣品。
　　2.1.2.3大鼠血漿樣品分析方法采用HPLC法分析待測(cè)樣品的化學(xué)成分

8、。色譜條件：同“延胡索總生物堿成分分析方法”，進(jìn)樣量：20μL。
　　2.2白芷主活性成分研究
　　2.2.1白芷總香豆素提取和成分分析及其含量測(cè)定
　　2.2.1.1白芷總香豆素提取方法按照《中國藥典》（2010年版一部）收載的“元胡止痛軟膠囊”的制劑方法，制備白芷藥材提取物；然后，利用香豆素類物質(zhì)易溶于乙酸乙酯的特性提取白芷藥材提取物中的總香豆素。
　　2.2.1.2白芷總香豆素成分分析方法采用HPLC法分析

9、白芷總香豆素提取物的化學(xué)成分。色譜條件：色譜柱：Phenomenex Luna-C18 column(250×4.6 mm，5.0μm)；流動(dòng)相：乙腈（A）、0.1％磷酸水溶液（三乙胺調(diào)至pH6.0， B）；梯度洗脫程序：0～5min，4％A；5～30 min，4～28％A；30～55 min，28～31％A；55～80 min，31～70％A；80～90 min，70～80 A；90～95 min，80％A；柱溫：40℃；流速：1 m

10、L/min；檢測(cè)波長：300 nm，進(jìn)樣量：10μL。
　　2.2.2白芷總香豆素提取物大鼠體內(nèi)成分定性分析
　　2.2.2.1大鼠血漿樣品制備方法大鼠灌胃白芷總香豆素提取物2.5 h后，通過大鼠肝門靜脈取血約1 mL于肝素抗凝管中抗凝，3500 r/min離心10 min后即得血漿樣品。
　　2.2.2.2大鼠血漿樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確吸取大鼠血漿500μL于具塞玻璃離心管中，加入3 mL乙酸乙酯萃取液，于渦旋混合器上混

11、勻5 min，3500 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，合并兩次萃取液于潔凈的玻璃離心管中，置于氮吹儀中40℃吹干即得待測(cè)樣品。
　　2.2.2.3大鼠血漿樣品分析方法采用HPLC法分析待測(cè)樣品的化學(xué)成分。色譜條件：同“白芷總香豆素成分分析方法”，進(jìn)樣量：20μL。
　　2.3延胡索乙素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　2.3.1大鼠血漿樣品制備方法大鼠灌胃延胡索乙素（tetrahydropalmatine；TDE）后

12、0，0.083，0.17，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12 h，通過大鼠眼底靜脈叢取血約0.4 mL于肝素抗凝管中抗凝，3500 r/min離心10 min后即得血漿樣品。
　　2.3.2大鼠血漿樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確吸取大鼠血漿200μL于具塞玻璃離心管中，分別加入10μL內(nèi)標(biāo)液（延胡索甲素corydaline；CDE），50μL堿化試劑（NaOH；1 mol/L）混勻；加入1.5 mL正己烷-異丙醇（95:5）

13、萃取液后，于渦旋混合器上混勻5 min，3500 r/min離心10 min，取萃取液置于潔凈的玻璃離心管中，置于氮吹儀中40℃吹干即得待測(cè)樣品。
　　2.3.3大鼠血漿樣品分析方法采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定大鼠含藥血漿中TDE的含量。色譜條件：色譜柱：Hypersil BDS C18 column(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1％磷酸（三乙胺調(diào)至PH6.2）（60:40）；柱溫：30℃；流速：1 mL/mi

14、n；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長：280 nm。
　　2.4歐前胡素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　2.4.1大鼠血漿樣品制備方法大鼠灌胃歐前胡素（imperatorin，IMP）后0，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，10 h，通過大鼠眼底靜脈叢取血約0.4 mL于肝素抗凝管中抗凝，3500 r/min離心10 min后即得血漿樣品。
　　2.4.2大鼠血漿樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確吸取大鼠血漿200μ

15、L于具塞玻璃離心管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)液（異歐前胡素 isoimperatorin；ISO）混勻；加入1.5 mL乙酸乙酯-石油醚（1:1）萃取液，置于渦旋混合器上混勻5 min，3500 r/min離心10 min，取萃取液于潔凈的玻璃離心管中，置于氮吹儀中40℃吹干即得待測(cè)樣品。
　　2.4.3大鼠血漿樣品分析方法采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定大鼠含藥血漿中IMP的含量。色譜條件：色譜柱：Hypersil BDS C18 column(250

16、mm×4.6mm i.d.，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（60:40）；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長：300 nm。
　　2.5歐前胡素大鼠體內(nèi)組織分布研究
　　2.5.1大鼠組織樣品制備方法大鼠灌胃IMP后0.5，1.5，2.5，4，6，8 h，斷頭處死并迅速取出腦、心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢等組織；心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢用少量生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后置于-80℃冰箱儲(chǔ)

17、存；將腦組織清洗干凈后立即置于冰盤上，使用眼科鑷將腦組織分離為大腦皮層、小腦、腦干、間腦、紋狀體、海馬等部分，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存。
　　2.5.2大鼠組織樣品預(yù)處理方法大腦皮層、小腦、腦干、間腦、心、肝、脾、肺、腎稱重后，以1:15比例加入生理鹽水；紋狀體、海馬、子宮、卵巢稱重后，以1:30比例加入生理鹽水；將各組織樣品置于冰浴條件下，用組織勻漿器勻漿；然后將獲得的組織勻漿置于離心機(jī)中，12000 r/min離心10 min后取

18、上清液500μL于潔凈玻璃離心管中；加入20μL內(nèi)標(biāo)液（ISO）和3 mL乙酸乙酯-石油醚（1:1）萃取液，渦旋混勻5 min，3500 r/min離心10 min，取萃取液于潔凈的玻璃離心管中，置于氮吹儀中40℃吹干即得待測(cè)樣品。
　　2.5.3大鼠組織樣品分析方法同IMP大鼠血漿樣品分析方法。
　　2.6歐前胡素對(duì)延胡索乙素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)特性影響研究過程同TDE大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　

19、　3.1延胡索中主活性成分研究建立的HPLC法能夠同時(shí)檢測(cè)延胡索總生物堿提取物中多種物質(zhì)，其中定量分析了10種（原阿片堿：PTP；別隱品堿：AYE；黃連堿：CTE；海罌粟堿：GUE；巴馬汀：PME；小檗堿：BRE；去氫紫堇堿：DDE；TDE；四氫小檗堿：THE；CDE），其中DDE、TDE、CDE含量較高；這些物質(zhì)中，大鼠口服延胡索總生物堿提取物后檢測(cè)到6種（PTP、AYE、GUE、PME、TDE、CDE），但并未檢測(cè)到延胡索總生物堿提

20、取物中含量最高的DDE，而TDE的止痛活性優(yōu)于CDE，因此本研究初步認(rèn)為TDE為延胡索的主活性成分。
　　3.2白芷中主活性成分研究建立的HPLC法能夠同時(shí)檢測(cè)白芷總香豆素中多種物質(zhì)，其中定量分析了6種（花椒毒酚：XTT；花椒毒素：XTX；佛手苷內(nèi)酯：BAT；異茴芹內(nèi)酯：IPN；IMP；ISO），其中IMP含量最高；這些物質(zhì)中，大鼠口服白芷總香豆素提取物后全被檢測(cè)到，因此本研究初步認(rèn)為IMP為白芷的主活性成分。
　　3.3延

21、胡索乙素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究 TDE代謝模型為二室模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC(0-t)：6.44±1.69 mg/L/h；AUC(0-∞)：8.62±3.03 mg/L/h；T1/2z：6.92±4.35 h；Tmax：0.63±0.23 h；Cmax：2.29±0.82 mg/L。
　　3.4歐前胡素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究 IMP代謝模型為二室模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC(0-t)：6.52±2.25 mg/L/h；AU