新型抗癲癇藥對MDR的影響及MDR1逆轉(zhuǎn)劑在癲癇治療中的應(yīng)用價值研究.pdf

1、癲癇（epilepsy）是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫大腦功能障礙的一種慢性腦部疾患。癲癇的患病率約為5％0，在兒童和青少年期發(fā)病率較高。其中大約有25％的癲癇患者對多種抗癲癇藥物耐藥而發(fā)展為難治性癲癇。 目前對于難治性癲癇耐藥機制的研究主要集中在3個方面：（1）神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大部分患者存在AHS（Ammon's horn scelrosis，Ammon's角硬化），其主要表現(xiàn)為海馬CA1、CA3、CA4區(qū)及齒狀回顆粒細

2、胞層存在神經(jīng)元缺失和反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生，近年認為這種改變可能與線粒體的功能失調(diào)有關(guān)，并參與耐藥機制的形成；（2）生理和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)藥物靶點的變化可以引起藥物敏感性的改變，一線抗癲癇藥物的主要作用位點是海馬區(qū)神經(jīng)元的電壓門控通道，同時電壓門控鈉離子通道的改變是多種癲癇的共同致病機制；（3）免疫學(xué)和分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因和蛋白參與耐藥的形成，這是近年來研究的熱點。其中以ATP結(jié)合的蛋白質(zhì)超家族（ATP-Binding Casset

3、te，ABC）運輸?shù)鞍籽芯孔疃?。越來越多的學(xué)者認為難治性癲癇的耐藥機制與多種藥物運輸?shù)鞍走^量表達而導(dǎo)致的抗癲癇藥物不能有效進入腦細胞有關(guān)，其中MDR（Multidrug resistance gene，多藥耐藥基因）及其表達產(chǎn)物P-糖蛋白（P-gp）倍受關(guān)注。 有研究表明mdr1在癲癇模型腦中的過度表達可能是由反復(fù)癲癇發(fā)作引起。但癲癇患者，尤其是難治性癲癇患者需要長期服用抗癲癇藥物，抗癲癇藥物尤其抗癲癇新藥是否對多藥耐藥基因的表

4、達產(chǎn)生影響已引起學(xué)者們的關(guān)注，但相關(guān)的研究仍較少。 近年學(xué)者們對多藥耐藥基因的研究多以成年大鼠急性期癲癇持續(xù)狀態(tài)為模型，對慢性癲癇及幼鼠模型的研究較少，但許多研究表明，在個體發(fā)育的不同階段，癲癇的產(chǎn)生、維持及對抗癲癇藥物的反應(yīng)亦不盡相同。眾所周知，兒童癲癇的發(fā)生率遠遠高于成人。因此，研究抗癲癇藥對慢性癲癇幼年大鼠模型海馬中mdr1表達的影響，更能貼近臨床，從而為臨床治療提供新的依據(jù)。 如上所述，多藥耐藥的主要發(fā)病機制是由

5、于多藥耐藥基因及其表達產(chǎn)物P-gp蛋白在腦組織中的過度表達，導(dǎo)致抗癲癇藥物不能有效的進入腦細胞，從而使抗癲癇藥物在腦內(nèi)及神經(jīng)元內(nèi)不能達到有效的濃度，是引起癲癇治療失敗的重要原因。因此，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥基因的過表達對于促進抗癲癇藥物進入腦內(nèi)、提高癲癇的療效將會具有很大的臨床應(yīng)用價值。目前對于多藥耐藥基因逆轉(zhuǎn)劑的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，在癲癇領(lǐng)域的研究較少。因此，研究逆轉(zhuǎn)劑對難治性癲癇多藥耐藥基因的逆轉(zhuǎn)作用將會為難治性癲癇的治療提供更廣闊的前景

6、。 目的: 1.以海人酸致癲癇持續(xù)狀態(tài)后形成的慢性自發(fā)性顳葉癲癇幼年大鼠模型為研究對象，探討多藥耐藥基因及其表達產(chǎn)物在大鼠海馬中的表達及抗癲癇新藥拉莫三嗪對其表達的影響。 2.利用海人酸制備的慢性自發(fā)性顳葉癲癇幼年大鼠模型探討左乙拉西坦對多藥耐藥基因及其表達產(chǎn)物在大鼠海馬中表達的影響，從而指導(dǎo)臨床用藥。 3.探討多藥耐藥基因逆轉(zhuǎn)劑鹽酸地爾硫卓對癲癇幼鼠海馬中多藥耐藥基因表達的影響。為難治性癲癇的臨床治療開

7、辟新的途徑。 4.探討難治性癲癇患兒外周血中多藥耐藥基因的表達及多藥耐藥基因逆轉(zhuǎn)劑氟桂利嗪在小兒難治性癲癇輔助治療中的作用。 方法: 1.將出生后7d的雄性Wistar大鼠65只隨機分為海人酸（kainic acid，KA）組33只和對照組32只，KA組給予KA1mg/kg（濃度0.5mg/ml）腹腔注射，對照組只腹腔注射相同劑量生理鹽水。按照Lado幼鼠癲癇發(fā)作分級標準，腹腔注射后連續(xù)觀察8h，癲癇發(fā)作達5級以

8、上癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠若兩周后出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)驚厥發(fā)作則為造模成功。 將KA組中造模成功的26只存活大鼠隨機分為癲癇未治療（EP）組13只、癲癇拉莫三嗪治療（EP+LTG）組13只，對照組隨機分為生理鹽水（NS）組、生理鹽水拉莫三嗪治療（NS+LTG）組各16只。治療組均于自發(fā)性發(fā)作出現(xiàn)一周后給予抗癲癇新藥拉莫三嗪治療8周，然后將所有大鼠斷頭取海馬，用RT-PCR法測定多藥耐藥基因mdr1a和mdr1b mRNA的表達。 2

9、.選用生后7d（P7）的Wistar大鼠70只，隨機分為癲癇觀察組38只和正常對照組32只。癲癇觀察組給予海人酸KA1mg/kg（0.5ml/kg），腹腔注射致癇，對照組應(yīng)用相同方法給予相同劑量的生理鹽水。待慢性癲癇模型建立后，癲癇觀察組隨機分為慢性癲癇（EP）觀察組13只，慢性癲癇左乙拉西坦治療（EP+LEV）組15只；對照組分為生理鹽水（NS）組和生理鹽水左乙拉西坦治療（NS+LEV）組各16只。治療組給予左乙拉西坦（80mg/kg

10、）灌胃，治療8周后，斷頭取海馬，稱重，RT-PCR法測定mdr1a和mdr1b mRNA的表達。 3.將出生后7d的雄性Wistar大鼠75只隨機分為海人酸組39只和對照組36只，KA組給予KA腹腔注射，對照組腹腔注射相同劑量生理鹽水。造模成功后將海人酸組中存活大鼠31只隨機分為癲癇未治療（EP）組10只、癲癇拉莫三嗪治療（EP+LTG）組11只，癲癇加拉莫三嗪及鹽酸地爾硫卓治療（EP+LTG+D）組10只。對照組隨機分為生理鹽

11、水（NS）組、生理鹽水拉莫三嗪治療（NS+LTG）及生理鹽水拉莫三嗪加鹽酸地爾硫卓治療（NS+LTG+D）組各12只。治療組均于自發(fā)性發(fā)作出現(xiàn)1周后給予拉莫三嗪或拉莫三嗪加鹽酸地爾硫卓治療8周，然后將所有大鼠斷頭取海馬，用RT-PCR法測定mdr1a和mdr1b mRNA的表達。 4.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測MDR1在22例正常健康查體兒童和輔助治療前后64例難治性癲癇患兒（其中氟桂利嗪組36例，安慰劑組28例）外周血中的表達情

12、況，同時，進行臨床療效和藥物不良反應(yīng)觀察。 結(jié)果: 1.EP組、EP+LTG組的mdr1a和mdr1b mRNA表達均比NS組明顯增高（P<0.001）；EP+LTG組及NS+LTG組的mdr1a和mdr1b mRNA表達分別較EP組及NS組增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 2.EP組、EP+LEV組的mdr1a和mdr1b mRNA表達明顯增高于NS組和NS+LEV，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；

13、 EP組mdr1a和mdr1b mRNA表達高于EP+LEV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）； NS+LEV組與NS組相比，mdr1a和mdr1b mRNA表達有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 EP組大鼠腦重下降15.3％（EP組0.137±0.018g； NS組0.158±0.015g，P<0.01）：EP+LEV與EP組相比，升高8.1％（EP+LEV組0.149±0.013g，EP組0.137±0.01

14、8g，P<0.05）； NS+LEV組較NS下降3.3％（NS+LEV組0.153±0.017g；NS組0.158±0.015g，P>0.05）。 3.EP+LTG+D組的mdr1a和mdr1b mRNA表達低于EP組及EP+LTG組（P<0.05），NS+LTG+D組與NS+LTG組及NS組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。 4.難治性癲癇組患兒未進行輔助治療前MDR1mRNA的表達水平明顯高于正常對照組（P<0.01

15、）。輔助治療后，氟桂利嗪組MDR1 mRNA的表達低于安慰劑組（P<0.01），但高于正常對照組（P<0.05）；安慰劑組MDR1 mRNA的表達比正常對照組高1.14倍。與輔助治療前相比，氟桂利嗪組MDR1 mRNA表達降低（P<0.01），安慰劑組增高（P<0.05）。氟桂利嗪組與安慰劑組治療有效率分別為55.56％和3.57％。氟桂利嗪不良反應(yīng)發(fā)生率為8.33％。 結(jié)論: 1.反復(fù)癲癇發(fā)作可使癲癇幼鼠海馬中mdr1

16、a、mdr1b mRNA表達增加。 2.拉莫三嗪對癲癇及正常幼鼠海馬中mdr1a、mdr1b mRNA的表達無明顯影響。 3.左乙拉西坦可使大鼠海馬多藥耐藥基因的表達減少，使癲癇大鼠海馬的重量增加，但使正常大鼠海馬重量減輕。 4.鹽酸地爾硫卓可以逆轉(zhuǎn)mdr1 mRNA的表達。 5.檢測外周血MDR1 mRNA的表達可以評估難治性癲癇患兒對抗癲癇藥物的敏感程度。 6.氟桂利嗪對MDR1mRNA的表達