布魯氏菌三個外膜脂蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性實驗.pdf

1、布魯氏菌病(brucellosis)是由布魯氏菌引起的人畜共患性傳染病，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。布魯氏菌病是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，全世界有超過170多個國家和地區(qū)存在人和動物的布魯氏菌病的流行。近年來，我國對布魯氏菌病進(jìn)行的監(jiān)測和分析，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病疫情暴發(fā)形勢較為嚴(yán)峻，羊、牛布布魯氏菌病感染率上升較快，成為法定報告?zhèn)魅静≈邪l(fā)病數(shù)上升速度最快的疾病之一。
　　 布魯氏菌外膜蛋白在穩(wěn)定細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)、適應(yīng)胞內(nèi)、外環(huán)境和抵

2、抗胞內(nèi)殺菌機(jī)制等方面起著重要作用，與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)系。外膜蛋白位于細(xì)菌的表面，參與細(xì)菌與宿主的相互作用，并且容易被免疫系統(tǒng)識別，激發(fā)免疫反應(yīng)。布魯氏菌的多種外膜蛋白都具有免疫原性，其中很大一部分是免疫保護(hù)抗原。因此，很多有關(guān)布魯氏菌致病機(jī)制和免疫反應(yīng)機(jī)制的研究都集中在外膜蛋白的研究上。
　　 本研究選取布魯氏菌外膜三個脂蛋白為研究對象，體外克隆、表達(dá)、純化這三個外膜蛋白，分析其免疫原性，探討其作為診斷抗原和亞單位疫苗候選蛋白

3、的可行性。
　　 本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的布魯氏桿菌外膜脂蛋白OMP10(GenBank：L27995.1)、OMP16(GenBank：JF918760.1)、OMP19(GenBank：L27997.1)的基因序列，利用DNASTARPrimer5軟件分別設(shè)計一對特異性引物。在三對引物上游都引入BamHⅠ酶切位點，下游引入HindⅢ酶切位點。通過煮沸的方法提取了布魯氏菌疫苗株S19全基因組DNA，以全基因組DNA為模

4、板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增出了三個脂蛋白的基因片段，大小分別為381bp、507bp、534bp。將擴(kuò)增的三個目的基因片段分別克隆入pEASY-T3，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α構(gòu)建了三個克隆載體：pEASY-T3/OMP10,pEASY-T3/OMP16，pEASY-T3/OMP19。經(jīng)雙酶切鑒定和測序比對正確后，分別提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ同時雙酶切重組克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)質(zhì)粒

5、，通過T4DNA連接酶將目的基因片段分別連接入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入DH5α，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：pET-32a/OMP10、pET-32a/OMP16、pET-32a/OMP19。經(jīng)雙酶切和測序鑒定后，分別將三個重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)。經(jīng)終濃度為1mM/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE、Western-blot鑒定和可溶性分析后，發(fā)現(xiàn)重組蛋白pET-32a/OMP10、pET-32a/OMP16、pET-32a

6、/OMP19為包涵體形式，采用Ni-NTASpinKit分別純化重組蛋白。用純化后的pET-32a/OMP10與弗氏完全佐劑和不完全弗氏佐劑等體積乳化后，采用背部皮下多點注射方式免疫4-6周齡小鼠。共免疫三次，每次間隔2周，于第3次免疫后7天進(jìn)行心臟采血。然后用4℃離心機(jī)5000rpm/min，離心10min，獲得抗血清。再以抗血清為一抗WesternBlot分析，觀測重組蛋白的免疫原性。
　　 結(jié)果本實驗成功構(gòu)建了含有三個脂蛋