牛泡沫病毒BTas蛋白TRE序列精細界定及其DNA結合域分析.pdf

1、牛泡沫病毒(Bovine Foamy Virus,BFV)是反轉錄病毒科泡沫病毒亞科泡沫病毒屬的成員,該病毒具有復雜的基因組結構和獨特的基因表達調節(jié)過程與傳統(tǒng)的反轉錄病毒區(qū)別較大。它的基因轉錄受到兩個啟動子的調節(jié),其中位于5’端的LTR負責結構基因的轉錄,位于env基因內(nèi)部的啟動子IP則調節(jié)BTas等非結構蛋白的合成,并且這兩個啟動子的活性都可被BTas蛋白激活。目前已經(jīng)清楚,LTR和IP中的Tas應答元件(TRE)為病毒復制所必需,并

2、且BTas可以結合于LTR上的TRE片段,本文即進一步在BTas與TRE的具體作用機制方面進行了一些研究。 利用本室分離的牛泡沫病毒BFV3026中國毒株為材料,主要進行了如下幾個方面的工作：(1)通過構建BTas蛋白一系列缺失體的原核表達質粒,對若干BTas缺失蛋白進行表達純化。利用純化的缺失蛋白以及制備TRE片段作為探針進行體外結合實驗,通過凝膠阻滯分析BTas的DNA結合結構域；(2)對已知TRE序列進行截短實驗,以期將T

3、RE區(qū)域進一步界定,從而確定與BTas結合的最小區(qū)域；(3)在將TRE縮短之后,進行激活功能研究：一方面通過缺失截短后的TRE片段以分析其在BTas激活過程中的作用,另一方面構建僅含應答元件的質粒,以檢測該片段能否獨立應答B(yǎng)Tas的激活。 BTas應答元件分為TREI和TREII,本文選擇TREII通過缺失實驗對其精細結構進行凝膠阻滯分析,發(fā)現(xiàn)了一段22bp的堿基序列為BTas最小結合區(qū),命名為Minimal TRE Domai

4、n, MTD。序列比對發(fā)現(xiàn),在TREII序列內(nèi)至少存在4個MTD。MTD突變序列分析證明,BTas與MTD的結合是直接的和特異性的,即BTas只能與特定的DNA序列識別并結合。利用Luc報告基因驗證了,在第四個MTD缺失的情況下BTas的激活作用受到了顯著的抑制；在串聯(lián)2個MTD存在的情況下BTas可以行使激活功能,第四段MTD對于應答B(yǎng)Tas的激活有著最為重要的作用。對BTas蛋白進行了DNA結合結構域的劃分,證實了BTas的N端為D