基于核酸探針構(gòu)型轉(zhuǎn)換的生物傳感放大技術(shù)研究.pdf

1、核酸適體是從人工構(gòu)建的隨機(jī)寡核酸文庫(kù)里篩選出來(lái)與配體高效、專一結(jié)合的DNA或RNA片段，這種篩選技術(shù)稱為“指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化”(SELEX)。適體能與靶物質(zhì)進(jìn)行高度特異性的結(jié)合。核酸適體的成功問(wèn)世，糾正了很久以來(lái)關(guān)于核酸只是遺傳信息存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的看法。核酸適體能特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)物、金屬離子等多種靶物質(zhì)。相對(duì)于抗體，適體還有特異性高、親和力好、制備運(yùn)輸簡(jiǎn)便、目標(biāo)廣泛等優(yōu)點(diǎn)。
　　正因?yàn)檫m體這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，適體作為

2、特異性的分子識(shí)別元件被廣泛應(yīng)用于生物傳感體系中。核酸適體生物傳感器(aptamer sensor)是一種能夠連續(xù)和可逆地進(jìn)行分子識(shí)別的裝置?；驹頌榇郎y(cè)物質(zhì)通過(guò)具有分子識(shí)別功能的接受器時(shí)，固定在接受器上的親合配基與待測(cè)生物分子相互作用的瞬間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)換能器，以電或光等方式輸出，經(jīng)過(guò)電子系統(tǒng)的放大處理和顯示，可以對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。這些傳感體系靈敏、快速、選擇性好，但是單純利用適配體結(jié)合靶分子前后引起信號(hào)改變的檢測(cè)方法，

3、在提高靈敏度方面十分有限。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度的目標(biāo)物進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，我們對(duì)傳感體系進(jìn)行了信號(hào)放大處理，本論文前兩部分內(nèi)容就是對(duì)適體檢測(cè)體系信號(hào)放大方法展開(kāi)研究，后一部分研究核酸探針HCR放大技術(shù)。
　　第二章設(shè)計(jì)了一種基于KF聚合酶反應(yīng)的電化學(xué)適配體傳感器，聯(lián)合二茂鐵功能化寡聚核苷酸，成功地檢測(cè)了可卡因小分子?？煽ㄒ虼嬖跁r(shí)，識(shí)別探針改變它的發(fā)卡構(gòu)象，形成三叉復(fù)合物。適配體-可卡因復(fù)合物3‘端單鏈部分與捕獲探針互補(bǔ)雜交。在聚合酶作用

4、下，以識(shí)別探針為模板，以捕獲探針為引物進(jìn)行聚合延長(zhǎng)反應(yīng)。二茂鐵標(biāo)記的dUTP聚合在新合成的互補(bǔ)探針中，達(dá)到信號(hào)放大的目的。
　　第三章設(shè)計(jì)了一種無(wú)標(biāo)記，自鎖式雙功能寡聚核苷酸探針，用于不同的疾病標(biāo)記物的平行檢測(cè)。兩種基于等溫循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)(CNDP)和循環(huán)非核酸目標(biāo)置換聚合反應(yīng)(CCDP)的信號(hào)放大技術(shù)分別用于檢測(cè)p53基因和PDGF-BB。在目標(biāo)物存在的情況下，雙功能探針與目標(biāo)物形成一個(gè)三叉復(fù)合物，解開(kāi)其中一個(gè)莖干的自-互補(bǔ)

5、部分，釋放出與引物互補(bǔ)的片段，引發(fā)等溫聚合取代反應(yīng)。產(chǎn)生大量的聚合產(chǎn)物，通過(guò)雙鏈插入劑SYBR Green I插入雙鏈DNAs，當(dāng)有單色光源的激發(fā)時(shí)，能發(fā)出放大的熒光，達(dá)到信號(hào)放大的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明基于等溫聚合取代反應(yīng)的雙功能探針檢測(cè)體系的有效性，且不需要化學(xué)標(biāo)記，具有設(shè)計(jì)彈性大、便捷性、簡(jiǎn)單性和成本低的特點(diǎn)。
　　第四章提出了一種基于HCR放大反應(yīng)檢測(cè)DNA單堿基突變的電化學(xué)傳感器。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的目標(biāo)鏈不僅與捕獲探針雜交，而且它