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1、目的:
本課題以大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞作為研究對(duì)象,從離體細(xì)胞研究層面,研究中藥密蒙花方對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,闡明其作用機(jī)理,為密蒙花方防治早期糖尿病視網(wǎng)膜病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
采用大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在30mmol/L高糖下培養(yǎng)48h,模擬高糖環(huán)境,作為模型組,再給予20%含密蒙花方血清(以下均稱含藥血清)干預(yù)12h、24h、36h作為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行
2、以下研究:
1.采用CCK-8法觀察密蒙花方對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞增殖的影響。
2.采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙色染色法觀察密蒙花方對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡的影響。
3.采用免疫熒光法觀察密蒙花方對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞內(nèi)GFAP,GS,GLAST,NMDA蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果:
1.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示:
①
3、高糖組較正常組吸光度值增高,具有統(tǒng)計(jì)意義(p<0.05)。10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L濃度組吸光值與正常組相比,明顯提高(p<0.05),且呈濃度依賴性。40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L濃度組吸光值與30mmol/L組相比明顯降低(p<0.05)。
?、诤幯甯深A(yù)12h時(shí),20%、40%濃度組吸光值與高糖組相比,明顯降低(p<0.05)。含藥血清干預(yù)24h時(shí),10%、20%、40%濃
4、度組吸光值與高糖組相比,明顯降低(p<0.05);含藥血清干預(yù)36h時(shí),5%、10%、20%、40%濃度組吸光值與高糖組相比,明顯降低,差異顯著p<0.05。空白血清組與高糖組比較,吸光值差異不顯著(p>0.05)。
2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:
高糖組較正常組細(xì)胞早期凋亡比例減少,活細(xì)胞比例增高,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(p<0.01):各含藥血清組與高糖組相比,細(xì)胞早期凋亡比例增高,活細(xì)胞比例減少(p<0.05)。
5、> 3.免疫熒光結(jié)果顯示:
?、貵FAP蛋白表達(dá):正常情況下Muller細(xì)胞不表達(dá)或少量表達(dá)GFAP,在高糖刺激下GFAP表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞連接緊密成網(wǎng)狀,線條清晰,分布由細(xì)胞膜向細(xì)胞核內(nèi)彌散。含藥血清干預(yù)12h,24h,36h后GFAP表達(dá)逐漸降低。
?、贕S蛋白表達(dá):高糖組較正常組細(xì)胞內(nèi)GS表達(dá)明顯降低,細(xì)胞連接斷裂,間隙增大,線條模糊,分布趨于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。含藥血清處理12h、24h、36h,GS表達(dá)明顯升高,線條
6、逐漸清晰,細(xì)胞間隙縮小。
?、跥LAST蛋白表達(dá):高糖組較正常組GLAST表達(dá)明顯下降,線條模糊,細(xì)胞間隙形成,分布近細(xì)胞膜處。含藥血清干預(yù)12h、24h、36h,使GLAST表達(dá)明顯增強(qiáng),細(xì)胞連接逐漸緊密,線條清晰,恢復(fù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
?、躈MDA蛋白表達(dá):高糖組較正常組NMDA表達(dá)明顯增強(qiáng),線條清晰,細(xì)胞連接緊密,細(xì)胞間隙減小,呈網(wǎng)狀排列,分布趨于細(xì)胞膜和胞質(zhì)。經(jīng)含藥血清干預(yù)后,表達(dá)逐漸減弱,線條較模糊,細(xì)胞連接斷裂,縫
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