涼血化瘀方對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生及VEGF表達的研究.pdf

1、通過建立體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞模型，觀察缺氧對該細胞的影響；采用唐由之研究員經(jīng)驗方?jīng)鲅龇阶鳛楦深A藥物，觀察不同濃度的涼血化瘀方中藥及服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生及VEGF表達的影響。從分子生物學及血清藥理學的角度探討年齡相關性黃斑變性中藥治療的療效機制，為中醫(yī)中藥治療年齡相關性黃斑變性提供實驗依據(jù)。 方法： 1、用胰酶消化法分離、培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞，免疫細胞

2、化學法對其進行鑒定。觀察細胞的生長過程及凍存、復蘇狀況。 2、用CoCl<,2>建立細胞化學缺氧模型，采用MTT法及WST-8法觀察缺氧對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生的影響。 3．WST-8法觀察不同濃度涼血化瘀方中藥和服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生的影響。 4．采用ELISA法檢測不同濃度涼血化瘀方中藥和服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細

3、胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響。 結果： 1、在原代細胞培養(yǎng)中，新鮮分離的RPE原代細胞在體外1～3d即可貼壁伸展，7～8d后，逐漸出現(xiàn)細胞集落，10～12d大部分培養(yǎng)瓶底部細胞呈融合狀態(tài)。隨著傳代次數(shù)增加，胞漿內的黑色素顆粒逐漸減少直至消失，細胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，類似成纖維細胞。復蘇細胞的存活率可達90％以上，相差倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)與凍存前相比無明顯差異。免疫細胞化學鑒定，CK陽性，S100陽性。

4、2、用CoCl<,2>建立RPE細胞化學缺氧模型，采用MTT法和WST-8法檢測細胞活性，結果顯示：終濃度為1mMol/L CoCl<,2>濃度過高，影響細胞活性，抑制細胞增殖。終濃度為1uMol/L、10uMol/L、100uMol/L CoCl<,2>培養(yǎng)的RPE細胞均明顯增殖，具有統(tǒng)計學差異，且其增生程度呈濃度依賴性，其中終濃度為100uMol/L CoCl<,2>培養(yǎng)的RPE細胞增殖最明顯，P<0.01。 3、觀察涼血化

5、瘀方中藥對RPE細胞的影響，結果顯示：終濃度為20mg/ml以上的涼血化瘀方中藥影響RPE細胞的活性。 4、采用涼血化瘀方中藥觀察其對缺氧狀態(tài)下人RPE細胞增殖的影響，結果顯示：終濃度為2mg/ml、200ug/ml的中藥抑制了缺氧狀態(tài)下人RPE細胞的增殖，且高濃度比低濃度更能明顯抑制人RPE細胞的增殖，P<0.01。 5、觀察服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生的影響，結果顯示：缺氧條件下

6、，10％、20％、40％大劑量含中藥鼠血清及20％中劑量含中藥鼠血清均抑制了缺氧狀態(tài)下人RPE細胞的增生，且其抑制程度呈濃度依賴性。 6、用ELISA法檢測不同濃度的涼血化瘀方中藥對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響，發(fā)現(xiàn)加入終濃度為2ug/ml、20ug/ml、200ug/ml和2mg/ml的涼血化瘀方中藥均降低了缺氧狀態(tài)下RPE細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量，具有統(tǒng)計學顯著差異，P<0.01。同時檢測服用

7、了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，5％中、大劑量含中藥鼠血清及10％、20％、40％各組劑量含中藥血清培養(yǎng)的人RPE細胞上清中VEGF含量均明顯降低，有統(tǒng)計學顯著差異，P<0.01。 結論： 1.正常人RPE細胞的體外培養(yǎng)、凍存及復蘇模式的建立，可為研究與RPE相關的眼底疾病的發(fā)病機制提供較好的體外細胞模型。 2.缺氧能引起RPE細胞顯著