Protectin DX對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:二十六碳烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)高度富集于視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞，經(jīng)脂氧合酶代謝可被轉(zhuǎn)化為protectin DX(PDX)。本研究目的為確定DHA衍生物PDX是否對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用及其機(jī)制，為脂類及其衍生物在年齡相關(guān)性黃斑變性防治研究方面提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。
　　方法:取生長(zhǎng)良好的ARPE-19（第16-18

2、代）細(xì)胞，以完全DMEM/F12培養(yǎng)基均勻接種于96孔板（2×104/0.1ml/孔）或六孔板（4×105/2.0 ml/孔），每日于倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至接近80％融合時(shí)，以無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基液饑餓細(xì)胞24小時(shí)。在200μM叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butylhydropero xide，t-BH)處理2h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)前，分別以0.05μM、0.5μM、1μM、5μM或10μM PDX預(yù)孵育ARPE-19細(xì)

3、胞20 min。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)結(jié)束后，以無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基液清洗細(xì)胞3次，去除多余t-BH。然后以含1％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基液繼續(xù)處理細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞或細(xì)胞上清樣本。其中:1）以含1％ FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基液處理細(xì)胞2小時(shí)，收集六孔板中的細(xì)胞用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè);2）以含1％ FBS的DM EM/F12培養(yǎng)基液處理細(xì)胞4小時(shí)，收集六孔板中細(xì)胞用于細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè);3）以含1％ FBS的

4、DMEM/F12培養(yǎng)基液處理細(xì)胞24小時(shí)，收集六孔板中的細(xì)胞用于T-AOC和SOD檢測(cè)及WB分析，或收集96孔板中的細(xì)胞上清用于ELISA檢測(cè)。
　　結(jié)果:200μM t-BH誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞2h，細(xì)胞內(nèi)dichloro fluorescein熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組顯著增強(qiáng)。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)結(jié)束后24 h細(xì)胞上清VEGF-A蛋白濃度較相同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組VEGF-A濃度增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。5μM PDX或10

5、μM PDX預(yù)孵育ARPE-19細(xì)胞20分鐘，可顯著降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后RPE細(xì)胞內(nèi)ROS生成量(P＜0.01)。以1μM、5μM或10μM PDX預(yù)孵育20 min，再對(duì)ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，細(xì)胞SOD活性分別是氧化應(yīng)激模型組的1.28倍、1.37倍和1.48倍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.001）;細(xì)胞T-AOC分別是氧化應(yīng)激模型組的1.40％、1.80％和2.07％，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

6、01，P＜0.001和P＜0.001）。當(dāng)PDX預(yù)孵育濃度≥0.05μM時(shí)，相同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基上清TNF-α蛋白濃度較氧化應(yīng)激模型組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)PDX預(yù)孵育濃度≥1μM時(shí)，培養(yǎng)基上清VEGF-A蛋白濃度較氧化應(yīng)激模型組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)PDX預(yù)孵育濃度為10μM時(shí)，氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)PGC-1α蛋白表達(dá)較氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞PGC-1α蛋白表達(dá)顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

7、01)。
　　結(jié)論:
　　1)200μM叔丁基過(guò)氧化氫處理ARPE-19細(xì)胞2小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增多，細(xì)胞分泌VEGF-A較正常狀態(tài)下顯著增加，細(xì)胞活力良好，表現(xiàn)出RPE細(xì)胞在經(jīng)歷慢性氧化應(yīng)激時(shí)的典型特征，可作為體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷模型。
　　2) Protectin DX可以顯著降低叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的炎癥及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子釋放，并通過(guò)直接增加PGC-1α表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)一步