高糖對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的研究.pdf

1、探討高糖（high glucose）對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（cultured human retinal pigmentepithelial cells-19，ARPE-19）細(xì)胞生長、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、線粒體DNA損傷標(biāo)記物8-羥基鳥嘌呤（8-oxo-7，8-dihydroguanine，8-oxoG）及DNA損傷修復(fù)標(biāo)記物8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（human8-oxoguanine

2、DNA glycosylasel，hOGG1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、色素上皮細(xì)胞衍生因子（pigment epithelium-derivedfactor，PEDF）表達(dá)的影響以及可能的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 [方法]
　　 體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19，隨機(jī)分成四組，即正常對(duì)照組用含5.6mmol.L-1葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)液，高糖組用30

3、 mmol.L-1葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)液，高糖+SB203580組用p38-MAPK（p38 mitogen activated protein kinase，p38-MAPK）特異性阻斷劑SB20358010μmol.L-1預(yù)處理30min后，再用含30 mmol.L-1葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)液，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）用含5.6 mmol.L-1葡萄糖和24.4 mmol.L-1甘露醇的DMEM/F12培養(yǎng)液。各組培養(yǎng)

4、24h、48h、72h，以MTT法檢測各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增生活力；以2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA）法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況；以免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）方法檢測細(xì)胞內(nèi)8-oxoG的表達(dá)情況，以蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測胞漿中hOGG1、TNF-α、PEDF的表達(dá)情況。
　　 [

5、結(jié)果]
　　 MTT法顯示：當(dāng)以不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液干預(yù)ARPE-19細(xì)胞后：①與正常對(duì)照組相比，高糖組、高糖+SB203580組在24h、48h、72h，均能抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖（P<0.01）。②與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）在24h、48h、72h，均不影響ARPE-19細(xì)胞的增殖（P>0.05）；③與高糖組相比，高糖+SB203580組在48h、72h，對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的抑制作用減弱（P<0.

6、05）。
　　 DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS顯示：①與正常對(duì)照組相比，高糖組、高糖+SB203580組干預(yù)ARPE-1924h、48h、72h，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量明顯增加（P<0.01），以72h干預(yù)時(shí)ROS表達(dá)水平最高，各組ROS表達(dá)量均有隨時(shí)間延長而增加的趨勢。②在24h、48h，高糖組、高糖+SB203580組ROS表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；在72h，高糖+SB203580組較之高糖組ROS表達(dá)量減少（P<0

7、.01）。⑨與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）在24h、48h、72h，均不影響ARPE-19細(xì)胞ROS的表達(dá)（P>0.05）。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示：①與正常對(duì)照組相比，高糖組、高糖+SB203580組干預(yù)ARPE-1924h、48h、72h，細(xì)胞內(nèi)8-oxoG表達(dá)量明顯增加（P<0.01），各組8-oxoG表達(dá)量均有隨時(shí)間增加的趨勢。②在24h、48h、72h，高糖+SB203580組較之高糖組8-oxoG表達(dá)

8、量減少（P<0.01）。③與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）在24h、48h、72h，均不影響ARPE-19細(xì)胞8-oxoG的表達(dá)（P>0.05）。
　　 蛋白免疫印跡法檢測顯示：（1）hOGG1：①與正常對(duì)照組相比，高糖組、高糖+SB203580組干預(yù)ARPE-1948h、72h，細(xì)胞內(nèi)hOGG1表達(dá)量明顯減少（P<0.01）。②在24h、48h，高糖組、高糖+SB203580組細(xì)胞內(nèi)hOGG1表達(dá)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

9、P>0.05）；在72h，高糖+SB203580組較之高糖組hOGG1表達(dá)量增加（P<0.05）。③高糖組、高糖+SB203580組在24h、48h、72h細(xì)胞內(nèi)hOGG1表達(dá)量有先下降后增高的趨勢。④與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）在24h、48h、72h，均不影響ARPE-19細(xì)胞hOGG1的表達(dá)（P>0.05）。
　　 （2）TNF-α：①與正常對(duì)照組相比，高糖組、高糖+SB203580組干預(yù)ARPE-1924h

10、、45h、72h，細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá)量明顯增加（P<0.01）。②在24h，高糖組、高糖+SB203580組細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；在48h、72h，高糖+SB203580組較之高糖組TNF-α表達(dá)量減少（P<0.05）。③與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透壓對(duì)照組）在24h、48h、72h，均不影響ARPE-19細(xì)胞TNF-α的表達(dá)（P>0.05）。
　　 （3）PEDF：①與正常對(duì)照組相比，高

11、糖組、高糖+SB203580組干預(yù)ARPE-1924h、48h、72h，細(xì)胞內(nèi)PEDF表達(dá)量明顯下降（P<0.01）。②在24h，高糖組、高糖+SB203580組細(xì)胞內(nèi)PEDF表達(dá)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；在48h、72h，高糖+SB203580組較之高糖組PEDF表達(dá)量增加（P<0.01）。③高糖組、高糖+SB203580組在24h、48h、72h細(xì)胞內(nèi)PEDF表達(dá)量有先減少后略增高的趨勢。④與正常對(duì)照組相比，甘露醇組（滲透