八肽膽囊收縮素對(duì)高糖所致大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM)作為一種人們熟知的代謝性疾病，隨著國家的發(fā)展以及人們生活方式的改變，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的第三大原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)作為糖尿病眼部病變最嚴(yán)重的并發(fā)癥，導(dǎo)致了每年不可逆的視力喪失的人數(shù)持續(xù)上升。其中老年黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)成為老年人群視力喪失的最常見原因，在65歲以上

2、的老年人中，每3個(gè)人中就會(huì)有一個(gè)受到AMD的影響。而國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)研究以及臨床試驗(yàn)都顯示:氧化應(yīng)激以及炎癥已經(jīng)成為AMD發(fā)生發(fā)展的兩大非常重要的原因。而視網(wǎng)膜本身也容易受到氧化應(yīng)激的影響，原因是代謝旺盛的視網(wǎng)膜的氧消耗量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于機(jī)體其他任何組織，多不飽和脂肪酸易被氧化且會(huì)激發(fā)具有細(xì)胞毒性的連鎖反應(yīng)。當(dāng)前已經(jīng)有大量的研究顯示:應(yīng)用高糖培養(yǎng)基刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial，RPE)，模擬糖尿病時(shí)

3、RPE細(xì)胞在體內(nèi)的高糖環(huán)境，造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，并應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示高糖使細(xì)胞的活力下降，使一些細(xì)胞因子、炎性因子的表達(dá)發(fā)生變化，對(duì)RPE細(xì)胞造成損傷。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的八肽膽囊收縮素(Cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作用于高糖培養(yǎng)的大鼠RPE細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力以及NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、及IL-6的表達(dá)的變化，根據(jù)結(jié)果篩

4、選出CCK-8合適的治療濃度，觀察此濃度作用RPE細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)上述因子的表達(dá)變化。
　　方法:
　　1.篩選CCK-8治療濃度:培養(yǎng)大鼠RPE細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為8組:①正常對(duì)照組（葡萄糖濃度:5.56mmol/L）②高糖組（葡萄糖濃度:30mmol/L）③高滲對(duì)照組（葡萄糖濃度:5.56mmol/L+甘露醇:24.44mmol/L）④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度:30 mmol

5、/L+CCK-8濃度:10-5mmol/L）⑤高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度:30mmol/L+CCK-8濃度:10-6mmol/L）⑥高糖+CCK-8治療組(葡萄糖濃度:30mmol/L+CCK-8濃度:10-7mmol/L)⑦高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度:30mmol/L+CCK-8濃度:10-8mmol/L）⑧高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度:30mmol/L+CCK-8濃度:10-9mmol/L），各組細(xì)胞應(yīng)用同種培

6、養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后換成條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度CCK-8對(duì)細(xì)胞活力的影響，同時(shí)收集細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6表達(dá)的變化。
　　2.不同時(shí)間段CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化:根據(jù)MTT及RT-PCR的結(jié)果得出CCK-8的治療濃度為10-6mmol/L，再次分組:①正常對(duì)照組（

7、葡萄糖濃度:5.56mmol/L）②高糖組(葡萄糖濃度:30mmol/L)③高滲對(duì)照組(葡萄糖濃度:5.56mmol/L+甘露醇:24.44mmol/L)④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度:30 mmol/L+CCK-8濃度:10-6mmol/L），各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，取相應(yīng)時(shí)間段細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)上述7種因子表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法檢測(cè)結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞的活

8、力明顯降低(P＜0.05)，高滲對(duì)照組細(xì)胞活力未見明顯改變;各不同濃度治療組的細(xì)胞活力低于正常對(duì)照組，具有明顯差異（P＜0.05），CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三組之間細(xì)胞活力無明顯差異，三組與高糖組相比無明顯差異，CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間細(xì)胞活力無明顯差異，但要高于其他三組治療組和高糖組(P＜0.05)。
　　2.篩選CCK-8治療濃度

9、階段RT-PCR結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，高糖組NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6的表達(dá)上升(P＜0.05)，高滲對(duì)照組的表達(dá)未見明顯差異。各不同濃度治療組與正常對(duì)照組相比，其中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。與高糖組相比，CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmo

10、l/L三組中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)上升(P＜0.05)，TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)下降(P＜0.05)，但是三組之間未見明顯差異。CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間未見明顯差異，但與其他三組治療組及高糖組相比，NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　3.不同時(shí)間段

11、CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化:與正常對(duì)照組相比，高滲對(duì)照組7因子的表達(dá)未見明顯差異;高糖組與正常對(duì)照組及高滲對(duì)照組相比，上述7種因子的表達(dá)明顯上升(P＜0.05);與高糖組相比，治療組NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，48小時(shí)高于24小時(shí)及72小時(shí)(P＜0.05)，24小時(shí)及72小時(shí)之間無明顯差異;與高糖組相比，治療組TNF-α、IL-1α及IL-6表達(dá)下降(P＜0.05)，72

12、小時(shí)的表達(dá)低于24小時(shí)和48小時(shí)(P＜0.05)，24小時(shí)和48小時(shí)間的表達(dá)無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.高糖環(huán)境可導(dǎo)致大鼠RPE細(xì)胞損傷，細(xì)胞活力降低。
　　2.10-6mmol/L濃度的CCK-8以及一定的作用時(shí)間后可以抑制高糖對(duì)細(xì)胞帶來的損傷，使NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1表達(dá)明顯上升，TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)明顯下降，提示了CCK-8可能通過抗氧化作用以及抗炎癥作用維持了細(xì)胞內(nèi)平衡