姜黃素對內源性神經干細胞Wnt-β-catenin信號通路影響的離體研究.pdf

1、目的:
　　隨著社會經濟的發(fā)展及人口的不斷老齡化,中樞神經系統(tǒng)疾病的風險因素如高血壓、糖尿病、外傷等因素逐年增加,中樞神經系統(tǒng)病變的發(fā)病率表現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢,CNS疾病具有致殘率高、致死率高等特點,給社會和家庭都帶來巨大的經濟損失和沉重的心理負擔。目前,手術、基因及康復治療等方法已被用于治療中樞神經系統(tǒng)損傷,雖然這些方法具有諸多優(yōu)越性,但大部分患者仍不能取得實質性的功能恢復。因此,CNS損傷的有效治療方法亟待解決。CNS損傷后,

2、損傷區(qū)域的神經干細胞(neural stem cells,NSCs)在刺激因素的作用下不斷增殖,且可以在刺激因素下向不同的神經細胞分化,包括星形膠質細胞(astrocyte Ast)、神經元(neuron N)、少突膠質細胞(oligodendrocyte Olig),而神經干細胞向這三者,尤其是向神經元細胞分化的比例,則在很大程度上決定了CNS損傷患者的預后。中藥姜黃在印度及我國的傳統(tǒng)醫(yī)學中應用廣泛,姜黃素(Curcumin)是姜黃的

3、提取物,為多酚類物質,具有多種生物活性而幾乎無副作用,姜黃素臨床應用的關鍵是闡明其作用機制。之前的大量研究已證明姜黃素具有神經保護作用及促分化作用。Kim等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在500nmol/L時其神經保護作用最強。激活 Wnt/β-catenin信號通路能顯著促進成年動物海馬區(qū)神經干細胞向神經元細胞的分化比例,在調控成年動物大腦中的神經再生中起關鍵性作用,目前已經明確wnt3a、β-catenin屬于經典的Wnt/β-catenin信號通

4、路,在神經發(fā)育中有重要作用。目前,尚無文獻報道在神經干細胞中,姜黃素與經典的 Wnt/β-catenin信號通路的關系。本實驗通過設計不同的干預條件,觀察各干預組對神經干細胞中Wnt信號通路的影響,利用Western blot、RT-PCR手段檢測Wnt信號通路中wnt3a、β-catenin蛋白及wnt3a、β-catenin的mRNA表達水平的變化,以此探索姜黃素與經典的Wnt/β-catenin信號通路之間的關系。本實驗試圖揭示姜

5、黃素神經保護的可能機制,為開拓神經保護治療的新途徑提供實驗依據。
　　材料與方法:
　　以孕14.5天左右的SD大鼠為研究對象。提取神經干細胞并以DMEM/F12基礎培養(yǎng)液中添加2％的B27、20ng/ml的bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)、20ng/ml的EGF(表皮生長因子)進行培養(yǎng),使用免疫細胞化學法進行神經干細胞的鑒定,連續(xù)培養(yǎng)3代后,設置五個干預組即:空白對照組;IWR-1組、姜黃素組、IWR-1+姜黃素組、DM

6、SO組,采用免疫熒光法檢測各組在干預72小時時的神經元細胞染色變化;采用Western-blot方法檢測各組在干預72h時wnt3a及β-catenin蛋白表達變化;采用RT-PCR法檢測各組在干預72小時時wnt3a及β-catenin基因表達情況。
　　結果:
　　1.研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第2代時神經干細胞球直徑及成球率明顯增多。免疫細胞熒光染色證實細胞部分巢蛋白Nestin陽性,經含血清的培養(yǎng)基誘導分化后部分細胞呈MAP2陽

7、性,部分細胞呈GFAP陽性,少部分細胞呈Olig2陽性。
　　2.將神經干細胞連續(xù)培養(yǎng)3代時分組干預并繼續(xù)培養(yǎng)72小時采用免疫熒光細胞技術進行染色發(fā)現(xiàn)IWR-1組表達MAP2陽性的神經元細胞比例明顯減少;姜黃素組神經干細胞向神經元細胞分化的比例升高,IWR-1聯(lián)合姜黃素組神經干細胞向神經元細胞分化比例較單獨使用姜黃素組減少,且與空白對照組及DMSO組無明顯差異。
　　3.細胞增值實驗提示,姜黃素可以激活 wnt/β-cate

8、nin信號通路,使神經干細胞向其他神經細胞分化。
　　4. Western blot提示:對神經干細胞分組干預后,姜黃素組wnt3a、β-catenin表達量較其他各組明顯升高(P<0.05),IWR-1處理后wnt3a、β-catenin表達水平較空白對照組明顯降低(P<0.05);IWR-1聯(lián)合姜黃素處理神經干細胞后檢測wnt3a、β-catenin表達量較姜黃素組減少(P<0.05);DMSO組表達量接近空白對照組。采用RT

9、-PCR法提示:姜黃素組 wnt3a及β-catenin基因表達水平較空白對照組表達量顯著上調(P<0.05),IWR-1組神經干細胞中 wnt3a及β-catenin基因表達水平較空白對照組表達量下降(P<0.05),基因表達情況與Western blot結果相近。
　　結論:
　　1.給予姜黃素后可以提高神經干細胞向神經元細胞的分化比例,說明姜黃素具有神經保護作用。
　　2.對神經干細胞進行分組干預后,使用IWR-