PSMD1和ATG3基因在骨髓增生異常綜合征向白血病轉(zhuǎn)變中作用的研究.pdf

1、第一部分 siRNA沉默PSMD1基因?qū)撬柙錾惓＞C合征細(xì)胞系SKM-1生物學(xué)特性的影響
　　 目的：我們課題組采用巢式病例對(duì)照研究，首次建立了我國(guó)435例成人初發(fā)、未治的骨髓增生異常綜合征(MDS)患者的研究隊(duì)列，并對(duì)其隨訪。至隨訪終點(diǎn)，383例(88％)患者得到隨訪，52例(12％)患者失訪。共有41例患者轉(zhuǎn)化為急性白血病(病例組)，358例患者未轉(zhuǎn)化為急性白血病(對(duì)照組)。從病例組挑選3例患者，將起病時(shí)和轉(zhuǎn)白時(shí)的骨髓標(biāo)本

2、進(jìn)行人全基因組表達(dá)芯片檢測(cè)，完成自身對(duì)照研究。按照1:1配比，從病例組和對(duì)照組中各挑選滿足配對(duì)條件的3例患者的起病時(shí)骨髓標(biāo)本進(jìn)行全基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)，完成病例對(duì)照研究。最終篩選出由6條基因組成的子集，可以將病例組和對(duì)照組明顯、穩(wěn)健地區(qū)別開(kāi)。這6條基因按差異程度依次為TUBB、PSMD1、SLC7A5、ATG3、TUBB2C和TIMM10。其中，差異最大的為TUBB基因，課題組成員已完成對(duì)它的研究，所以我們選取了差異僅次于TUBB基因的P

3、SMD1基因進(jìn)行下一步研究。
　　 本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)對(duì)PSMD1基因進(jìn)行沉默，觀察PSMD1基因沉默前后MDS SKM-1細(xì)胞系生物學(xué)特性的變化，初步探討PSMD1基因可能在MDS向白血病轉(zhuǎn)變(轉(zhuǎn)白)過(guò)程中的作用。
　　 方法：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，在MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系SKM-1中導(dǎo)入化學(xué)合成的PSMD1特異性siRNA。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。使用Realtime PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)

4、胞中PSMD1基因水平的表達(dá)情況。觀察、比較PSMD1基因沉默前后SKM-1細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化，以及對(duì)nod/scid小鼠模型的影響。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染PSMD1特異性siRNA后24小時(shí)，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組PSMD1基因的mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。轉(zhuǎn)染組PSMD1特異性siRNA沉默PSMD1基因后，SKM-1細(xì)胞系的增殖受到抑制(P<0.05)。與陰

5、性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PSMD1特異性siRNA沉默PSMD1基因后，SKM-1細(xì)胞系的G2期細(xì)胞比例下降，而S期細(xì)胞比例上升，提示PSMD1-siRNA主要作用于S/G2限制點(diǎn)，從而將SKM-1細(xì)胞周期阻滯在S/G2。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PSMD1特異性siRNA沉默PSMD1基因后，SKM-1細(xì)胞與陰性對(duì)照組SKM-1細(xì)胞相比，早期凋亡(24.7％Vs3.5％)與晚期凋亡(5.6％Vs0.6％)的細(xì)胞比例均明顯上升(P<0.05)。對(duì)

6、PSMD1-siRNA轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的nod/scid小鼠觀察15天，結(jié)果顯示：兩組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，尚未出現(xiàn)明顯的納差、消瘦、萎靡少動(dòng)、毛色晦暗、松散等與MDS/AML相關(guān)的癥狀，可能與模型的建立時(shí)間尚短有關(guān)，還需對(duì)小鼠繼續(xù)觀察。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染PSMD1特異性siRNA，沉默：PSMD1基因后，SKM-1細(xì)胞系的增殖能力發(fā)生抑制，細(xì)胞周期被阻滯在S/G2期，細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯增多。nod/scid小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PS

7、MD1-siRNA轉(zhuǎn)染組的小鼠與陰性對(duì)照組相比，成瘤率、存活率未見(jiàn)明顯區(qū)別。提示SKM-1細(xì)胞沉默PSMD1基因后腫瘤生物學(xué)行為有所改變，惡性程度有所降低，但對(duì)nod/scid小鼠模型的影響尚不明確，仍需繼續(xù)觀察；PSMD1基因可能通過(guò)影響MDS的泛素蛋白酶體系統(tǒng)在MDS轉(zhuǎn)白過(guò)程中起作用。
　　 第二部分增強(qiáng)ATG3基因表達(dá)對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞系SKM-1生物學(xué)特性的影響
　　 目的：我們已經(jīng)通過(guò)巢式病例對(duì)照研究和全

8、基因組表達(dá)譜芯片分析，篩選出了6條基因組成的子集，可以將病例組和對(duì)照組穩(wěn)健區(qū)分。其中，5條差異基因?yàn)樯险{(diào)基因，僅ATG3為下調(diào)的差異基因。
　　 本研究應(yīng)用慢病毒技術(shù)，提高SKM-1細(xì)胞系中ATG3基因的表達(dá)，觀察ATG3基因過(guò)表達(dá)前后MDS細(xì)胞系生物學(xué)特性的變化，初步探討ATG3基因可能在MDS轉(zhuǎn)白過(guò)程中的作用。
　　 方法：構(gòu)建帶有ATG3基因的慢病毒載體，通過(guò)慢病毒感染SKM-1細(xì)胞系，提高SKM-1細(xì)胞系中ATG

9、3基因的表達(dá)。使用western blot從蛋白水平檢測(cè)ATG3表達(dá)情況。使用Realtime PCR檢測(cè)病毒滴度。表達(dá)觀察和比較ATG3基因過(guò)表達(dá)前后MDS轉(zhuǎn)白細(xì)胞系在細(xì)胞活力、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡、nod/scid小鼠模型等生物學(xué)特性的改變。
　　 結(jié)果：構(gòu)建慢病毒后，測(cè)序結(jié)果顯示與目標(biāo)序列一致，western blot檢測(cè)質(zhì)粒表達(dá)情況，結(jié)果顯示條帶與目的基因融合蛋白吻合，質(zhì)粒構(gòu)建成功。運(yùn)用RealtimePCR檢測(cè)病毒滴度為

10、2×108TU/ml。將帶有ATG3基因的過(guò)表達(dá)慢病毒感染細(xì)胞72小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(CCK-8法)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，慢病毒感染組的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(P<0.05)。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，ATG3過(guò)表達(dá)慢病毒感染后的細(xì)胞活力為65％，陰性對(duì)照組的細(xì)胞活力為79％(P<0.05)。ATG3慢病毒過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞與陰性對(duì)照的SKM-1細(xì)胞相比，早期凋亡(19.4％Vs47.7％)的細(xì)胞比例下降，而晚期凋亡和死亡(34.2 Vs14.

11、1％)的細(xì)胞比例明顯上升。對(duì)ATG3過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組的nod/scid小鼠觀察15天，兩組小鼠均未出現(xiàn)明顯的弓背、消瘦、萎靡少動(dòng)、毛色晦暗、松散等與MDS/AML相關(guān)的癥狀，可能與模型的建立時(shí)間尚短有關(guān)，還需對(duì)小鼠繼續(xù)觀察。
　　 結(jié)論：將過(guò)表達(dá)ATG3基因的慢病毒載體感染SKM-1細(xì)胞系后，SKM-1細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變。ATG3過(guò)表達(dá)慢病毒感染后的SKM-1細(xì)胞死亡比例高于陰性對(duì)照組。ATG3過(guò)表達(dá)慢病毒感染SKM-