單增李斯特菌及溶血素O與葡萄球菌三種腸毒素免疫膠體金檢測技術(shù)研究.pdf

1、本文首先根據(jù)NCBI檢索李斯特菌溶血素O(hly)序列(登錄號：[gi：134116121])，設計引物，常規(guī)PCR擴增，并將其產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆測序質(zhì)粒pMD18-T-hly，進行序列分析鑒定。結(jié)果表明，PCR合成的hly基因序列與檢索到的向hly基因序列完全一致。然后用BamH I和Xhol I分別雙酶切pMDl 8-T-hly，載體和表達載體pET-32al(+)，并連接獲得重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)

2、-hly。經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，構(gòu)建相應的表達工程菌。利用溫度誘導，在30V誘導培養(yǎng)3.5h后，該工程菌的SDS-PAGE分析顯示，有一條相對分子質(zhì)量約為60kDa的表達蛋白區(qū)帶，與預期的LLO蛋白的大小相符。經(jīng)TotalLab2.0圖像軟件分析，重組LLO蛋白(rLLO)以包涵體形式存在，表達量約占全菌蛋白的65.48％。 根據(jù)重組蛋白C端帶有6×His標簽的特征，用螯

3、合鎳離子．次氨基三乙酸(Ni-NTA)的親和層析柱對重組蛋白進行一步純化。在變性條件下LLO經(jīng)pH梯度洗脫，目的蛋白出現(xiàn)在pH 4.5洗脫液中，其純度達96.21％，經(jīng)親和純化方法可獲得約2mg/ml的rLLO蛋白。 將單增李斯特菌和純化后的rLLO蛋白、葡萄球菌腸毒素免疫新西蘭大白兔分別制備抗單增李斯特菌和抗rLLO、SE的多克隆抗體，獲得的免疫血清經(jīng)正辛酸-硫酸銨分步沉淀法和蛋白A親和層析純化，其純度約達98％，定量抗體濃度

4、約為4mg/mL，間接ELISA法檢測抗體效價為1：10<'8>以上，WB結(jié)果表明所制備的抗原具有很好的免疫原性。純化后的抗單增李斯特菌、抗SE和抗rLLO多抗，利用膠體金免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法研制了膠體金檢測試紙條，用于檢測單增李斯特菌、SE和LLO，并對該方法進行特異性、敏感性、穩(wěn)定性等評價。該檢測方法能在5～10min內(nèi)完成樣品檢測，多種不同的菌、蛋白及近緣毒素檢測評價顯示該法特異性良好，檢測靈敏性高，SE在奶粉、血清、牛

5、奶、火腿腸等環(huán)境樣品的檢測敏感性也相同。其中單增李斯特菌的敏感性達到10<'6>CFU/mL，LLO的敏感性能達到150ng/mL，SEA的敏感性能達到10ng/mL，SEB的敏感性能達到1ng/mL，SEC的敏感性能達到10ng/mL；37℃15天加速試驗表明所研制的五種試紙條的穩(wěn)定性良好，保存期在一年以上。本研究建立的膠體金檢測方法靈敏、準確、特異性強，可進一步應用到檢驗檢疫部門對進出口食品中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢測實際工