三種有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)研究.pdf

1、單增李斯特菌是危害公共衛(wèi)生安全的首要致病菌，能引起人、畜共患的李斯特菌病，人體感染后表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，其致死率高達(dá)28％。肉類(lèi)企業(yè)經(jīng)常采用有機(jī)酸對(duì)其進(jìn)行防控，之所以采用有機(jī)酸是因?yàn)槠錅睾托?、有效性及易?shí)用性等優(yōu)點(diǎn)能夠滿(mǎn)足當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)于食品天然、新鮮、少加工及少添加劑等現(xiàn)代消費(fèi)需求。有機(jī)酸通常以噴淋液的形式用于肉表面的清洗減菌如乳酸和醋酸等，或者以添加劑的形式直接添加于肉制品中來(lái)抑菌如乳酸鹽和醋酸鹽等，乙酰丙酸也因其具有

2、同樣的抑菌效果而引入使用。但是，研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在弱酸中生長(zhǎng)一段時(shí)間后能夠增強(qiáng)其后續(xù)的耐酸力，即誘導(dǎo)性耐酸力，這一弱酸誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生的耐酸性能夠同時(shí)增強(qiáng)細(xì)菌穿越胃液的能力并提高毒力，最終會(huì)導(dǎo)致高危菌株的出現(xiàn)，對(duì)消費(fèi)者的健康安全造成很大威脅，因此對(duì)有機(jī)酸使用的安全性進(jìn)行評(píng)估，對(duì)于保證肉制品安全和消費(fèi)者安全健康具有十分重要的意義。之前的研究很少涉及到單增李斯特菌在即食肉制品及預(yù)制肉制品的弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)后的后續(xù)耐酸性，也很少?gòu)挠袡C(jī)酸酸根離

3、子的角度對(duì)有機(jī)酸的誘導(dǎo)耐酸性進(jìn)行研究。本研究以鹽酸誘導(dǎo)條件為對(duì)照組，設(shè)定了pH6.0下，4.75mM的L-乳酸、乙酰丙酸及醋酸三種有機(jī)酸處理組，檢測(cè)酸誘導(dǎo)后四株單增李斯特菌的后續(xù)耐鹽酸/膽酸力，同時(shí)從細(xì)胞膜組分變化和細(xì)胞胞內(nèi)代謝物的相對(duì)變化兩方面進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.四株單增李斯特菌的基本生長(zhǎng)狀況:每一株單增李斯特菌在pH6.0的弱酸中的生長(zhǎng)狀類(lèi)似，同一株細(xì)菌在相同時(shí)間進(jìn)入對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，最大菌落數(shù)

4、為8.9-9.2 lg CFU/mL;菌株間的生長(zhǎng)狀況有差異，菌株C1-056生長(zhǎng)速率較大，比其他三株菌提前兩個(gè)小時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。選取了第4小時(shí)和第11小時(shí)（C1-056-第9小時(shí)）的細(xì)菌作為后續(xù)酸激的菌體樣本。
　　2.四株單增李斯特菌的基本耐鹽酸和耐膽酸情況:處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的細(xì)菌的耐鹽酸及耐膽酸鹽的能力高于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。穩(wěn)定期的細(xì)菌各菌株之間的耐鹽酸及耐膽酸性差異不十分明顯，對(duì)數(shù)期各菌株之間的耐酸性差異顯著。血清型4b的耐酸性

5、要高于血清型1/2a的細(xì)菌。細(xì)菌的耐膽酸性存在很大的個(gè)體差異，與血清型無(wú)明顯相關(guān)性。
　　3.三種有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌的誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng):pH6.0的弱酸環(huán)境均誘導(dǎo)四株細(xì)菌產(chǎn)生了增強(qiáng)的后續(xù)耐鹽酸能力，與鹽酸對(duì)照組相比，三種有機(jī)酸誘導(dǎo)后均提高了細(xì)菌的后續(xù)耐酸性，各有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌誘導(dǎo)力的大小順序依次為:醋酸＞乙酰丙酸＞L-乳酸。鹽酸誘導(dǎo)后細(xì)菌的后續(xù)耐膽酸力減弱，但是有機(jī)酸的加入使各菌株的耐膽酸性增強(qiáng)。表明單增李斯特菌被有機(jī)酸誘導(dǎo)后

6、其耐鹽酸和耐膽酸能力的提高，不僅與pH梯度（氫離子的存在）有關(guān)，而且與有機(jī)酸酸根離子的存在有關(guān)。
　　4.四株單增李斯特菌細(xì)胞膜脂肪酸的基本組成及酸誘導(dǎo)后細(xì)胞膜組分的改變:四株細(xì)菌在最適生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞膜均含有11種脂肪酸(C14～C18)，包括6種支鏈脂肪酸，3種飽和直鏈脂肪酸及2種不飽和直鏈脂肪酸。其中前異脂肪酸的含量較高，多數(shù)菌株中各脂肪酸的含量順序?yàn)閍i-15＞ai-17＞i-15＞i-17，且前兩種脂肪酸

7、的比例之和大于50％。
　　酸誘導(dǎo)后細(xì)菌的細(xì)胞膜脂肪酸圖譜發(fā)生改變，多數(shù)菌株的前異脂肪酸C15∶0及直鏈脂肪酸C16∶0含量有所降低，而異脂肪酸C15∶0，C16∶0，C17∶0及前異脂肪酸C17∶0含量均有所升高。C15/C17和anteiso/iso脂肪酸的比值顯著降低，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值并未發(fā)生顯著變化，表明酸誘導(dǎo)后單增李斯特菌細(xì)胞膜的碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)，支鏈度降低但是飽和度未發(fā)生變化，也從一定程度上說(shuō)明弱酸誘導(dǎo)后細(xì)菌

8、的細(xì)胞膜流動(dòng)性有所降低。但是有機(jī)酸處理組的細(xì)菌細(xì)胞膜中各脂肪酸含量（C15/C17除外）與鹽酸對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，表明氫離子的存在(pH梯度)是促使單增李斯特菌細(xì)胞膜脂肪酸圖譜的變化的主導(dǎo)因素，與酸根離子的存在關(guān)系不大。結(jié)合有機(jī)酸誘導(dǎo)后細(xì)菌的耐酸響應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酸誘導(dǎo)后細(xì)胞膜脂肪酸圖譜發(fā)生改變是有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)的原因之一，且這一過(guò)程酸根離子的貢獻(xiàn)不大。
　　相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌的誘導(dǎo)性耐酸力與細(xì)

9、胞膜脂肪酸C15∶ C17比例的比值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，比值越高，耐酸力越弱，進(jìn)一步表明細(xì)胞膜脂肪酸的改變（碳鏈長(zhǎng)度降低）是有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌產(chǎn)生誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)重要原因之一。
　　5.四株單增李斯特菌細(xì)胞內(nèi)代謝組分的基本組成及酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)代謝組分的改變:四株單增李斯特菌中共檢測(cè)出54種代謝物，包括8種有機(jī)酸，9種碳水化合物及磷酸鹽，21種氨基酸及16種以脂肪酸類(lèi)物質(zhì)為主的代謝物。含量較高的是氨基酸類(lèi)，其次為脂肪酸類(lèi)物質(zhì)，糖類(lèi)物

10、質(zhì)和有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，甘油為所有代謝物中含量最高的成分。
　　酸誘導(dǎo)后四株細(xì)菌中均發(fā)生變化的物質(zhì)為2,4-二羥基丁酸，且所有酸處理組該物質(zhì)的含量均低于空白對(duì)照組。果糖的含量在三株細(xì)菌(R2-499，C1-056及N1-227)中發(fā)生變化，且酸誘導(dǎo)組中的含量均顯著低于對(duì)照組;葡萄糖在菌株R2-499和N1-227中的含量也發(fā)生顯著變化，誘導(dǎo)組含量也顯著低于對(duì)照組。但是上述物質(zhì)的含量在有機(jī)酸處理組和鹽酸對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異，表明氫離子的存

11、在（pH梯度）是促使單增李斯特菌細(xì)胞內(nèi)2,4-二羥基丁酸，果糖及葡萄糖含量發(fā)生變化的主導(dǎo)因素，與酸根離子的存在關(guān)系不大。結(jié)合有機(jī)酸誘導(dǎo)后細(xì)菌的耐酸響應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)2,4-二羥基丁酸，果糖及葡萄糖含量的改變是有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)的原因之一，且這一過(guò)程酸根離子的貢獻(xiàn)也不大。
　　天冬酰胺的含量在鹽酸誘導(dǎo)后的菌株N1-227和N3-013中含量增加，但是有機(jī)酸的加入使其含量降低，這與有機(jī)酸對(duì)單增李斯特誘導(dǎo)后的耐