膠體金放大型葡萄球菌B型腸毒素生物傳感器的研制.pdf

1、金黃色葡萄球菌腸毒素是引起食物中毒和院內(nèi)感染的最重要病原之一，葡萄球菌B型腸毒素（SEB）還是一種具有超抗原活性的外毒素，具有強(qiáng)大的生物學(xué)活性?？焖贆z測(cè)SEB對(duì)預(yù)防食物中毒、保障食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但傳統(tǒng)的SEB檢測(cè)方法由于存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高等不足，不能滿足快速檢測(cè)的要求，因此，有必要建立一種高效、靈敏、快速的SEB檢測(cè)方法。本論文利用抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，研制了SEB檢測(cè)的膠體金放大型電化學(xué)生物傳感器，應(yīng)用于食品的快

2、速檢測(cè)。
　　 獲得高特異性抗體是建立高靈敏度免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵。本論文首先通過(guò)基因工程方法高效表達(dá)了加入組氨酸標(biāo)簽的新型SEB抗原蛋白，在此基礎(chǔ)上制備了相應(yīng)的SEB抗體。具體包括：將克隆后含有組氨酸標(biāo)簽的SEB基因連接原核表達(dá)載體pET32a（+）并轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到功能性高效表達(dá)，獲得分子質(zhì)量約為31KDa的融合蛋白，經(jīng)Ni-NTA His Bind Resin方法進(jìn)行純化后，鑒定蛋白的免疫原性和特異性。SEB蛋白純品免疫新西

3、蘭兔，通過(guò)免疫親和層析柱純化獲得分子量約為120KDa的SEB抗體，經(jīng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線證實(shí)該抗血清與SEA、SEC1的交叉反應(yīng)率為1％，與肉毒毒素A的交叉反應(yīng)率小于0.01％，檢出限為0.001μg/L，IC50為0.51μg/L，表明所獲SEB抗體具有較高的特異性和親和力。
　　 初步建立了檢測(cè)SEB的新型生物傳感器檢測(cè)方法：制備了膠體金標(biāo)記的SEB抗體用于制作工作電極。通過(guò)膠體金的顏色判斷、紫外曲線和電鏡掃描結(jié)果，對(duì)粒徑約

4、為5nm和16nm的膠體金進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，結(jié)果表明：5nm粒徑的膠體金呈桔紅色，顆粒大小均一，適合于標(biāo)記SEB抗體；膠體金標(biāo)記SEB抗體的最低穩(wěn)定濃度15μg/ml，最適穩(wěn)定量為18μg/ml，標(biāo)記的最適pn值為7.8；經(jīng)膠體金免疫滲濾試驗(yàn)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，證實(shí)標(biāo)記后的SEB抗體探針具有較好的免疫活性和高特異性；在此基礎(chǔ)上，生物傳感器采用膠體金放大技術(shù)，三電極檢測(cè)系統(tǒng)，以Fe（CN）63-/Fe（CN）64-為電活性指示劑，將SEB抗體