SIRT1-p53、cAMP-CREB信號通路參與老年大鼠吸入麻醉致學(xué)習(xí)與記憶損害的機(jī)制研究.pdf

1、本課題共分為以下三部分:
　　第一部分 七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉對老年大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能的影響
　　目的:探索1.3％ Sev聯(lián)合50％ N2O吸入麻醉4h后對老年大鼠學(xué)習(xí)與記憶的影響。
　　方法:18月齡SD大鼠隨機(jī)分為麻醉組和對照組，麻醉組給予1.3％Sev+50％N2O吸入4h，對照組給予50％O2吸入4h。48h后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括6天定航訓(xùn)練（day1-day6），定航訓(xùn)練結(jié)束后24小時(shí)即第7

2、天進(jìn)行第1次空間探索實(shí)驗(yàn)，第14天進(jìn)行第2次空間探索實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析顯示在定航訓(xùn)練期Sev+N2O麻醉組較對照組逃逸潛伏期明顯延長(p=0.001)，訓(xùn)練后第2天(p=0.041)、第3天(p=0.003)、第5天(p=0.033)存在顯著性差異。隨著訓(xùn)練時(shí)間的漸進(jìn)，兩組逃逸潛伏期均隨時(shí)間顯著減少(p＜0.001)。定航訓(xùn)練期兩組的游泳速度無明顯差異(p=0.11)。第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)則顯示麻醉組在目標(biāo)象限

3、的游泳時(shí)間百分比和路程百分比均顯著小于對照組(p=0.022，p=0.009)，提示七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉4h致老年大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能損害。而第14天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示兩組在目標(biāo)象限的時(shí)間百分比和路程百分比已無明顯差異。
　　結(jié)論:七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉4h可導(dǎo)致老年大鼠短期學(xué)習(xí)與記憶功能損害。
　　第二部分 SIRT1-p53信號通路參與老年大鼠七氟醚聯(lián)合化亞氮吸入全麻后致學(xué)習(xí)記憶損害的機(jī)制研究
　　目的

4、:Silent information regulator1(SIRT1)是第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶sirtuin家族中的一員，在大腦內(nèi)廣泛表達(dá)并介導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)多種重要的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，如促進(jìn)細(xì)胞存活、增強(qiáng)DNA損傷后的修復(fù)以及減少細(xì)胞分化。本研究探討老年大鼠吸入麻醉后海馬區(qū)SIRT1-p53信號通路的變化、SIRT1在吸入麻醉致神經(jīng)毒性中的作用以及SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇（resveratrol）預(yù)處理的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法

5、:1）1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉后48小時(shí)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠斷頭取腦，通過Western Blot以及免疫組化染色檢測海馬區(qū)凋亡相關(guān)指標(biāo)cleavedcaspase-3、Bax等的表達(dá)，以及SIRT1、乙?；膒53的表達(dá);2）采用出生24h內(nèi)的新生大鼠進(jìn)行海馬原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后給予SIRT1抑制劑sirtinol、salermide及resveratrol或相同容積DMSO共培養(yǎng)24小時(shí)后再進(jìn)行吸入麻醉處

6、理2h，Western Blot以及免疫組化染色檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved caspase-3、Bax等的表達(dá)，以及SIRT1，乙酰化的p53的表達(dá);3）給予老年大鼠每天腹腔注射白藜蘆醇100mg/kg或?qū)φ談?，連續(xù)處理7天，第7天予以1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉4h，48h后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。吸入麻醉后48h及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠斷頭取腦，檢測海馬區(qū)凋亡相關(guān)指標(biāo)及SIRT1、乙酰化p53的表達(dá)情況。
　　

7、結(jié)果:1）吸入麻醉后48h及第7天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉組海馬區(qū)內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved caspase-3、Bax的表達(dá)明顯較對照組升高，同時(shí)NeuN/TUNEL雙標(biāo)結(jié)果也提示麻醉組海馬區(qū)內(nèi)的細(xì)胞凋亡與神經(jīng)元丟失增加。伴隨著細(xì)胞凋亡的增加，麻醉組海馬區(qū)內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)及p53的去乙?；苍黾?。第14天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后cleaved caspase-3、Bax的表達(dá)兩組已無顯著性差異，而麻醉組SIRT1也稍下降;2）在細(xì)

8、胞體外實(shí)驗(yàn)中，resveratrol預(yù)處理海馬原代神經(jīng)元細(xì)胞后內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)進(jìn)一步升高，乙?；膒53表達(dá)則相應(yīng)降低，同時(shí)凋亡指標(biāo)cleaved caspase-3、Bax以及DNA損傷指標(biāo)PARP-1、γH2AX的表達(dá)則明顯降低，提示SIRT1可抑制揮發(fā)性麻醉藥所致神經(jīng)毒性起到神經(jīng)保護(hù)作用。sirtinol、salermide則抑制SIRT1的表達(dá)及p53的乙?；蛲鲋笜?biāo)cleavedcaspase-3、Bax以及DNA損傷

9、指標(biāo)PARP-1、γH2AX的表達(dá)則較對照組明顯升高;3）水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示resveratrol處理組在定航訓(xùn)練期較單純麻醉組潛伏期明顯縮短(p=0.013)，分別在訓(xùn)練的第3天(p=0.020)、第4天(p=0.049)和第6天(p=0.044)出現(xiàn)顯著性差異。訓(xùn)練期兩組大鼠游泳速度無明顯差異(p=0.912)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中兩組目標(biāo)象限時(shí)間百分比和路程百分比均無顯著性差異。吸入麻醉后48h及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Western Blo

10、t及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均顯示resveratrol處理組cleaved caspase-3，Bax等的表達(dá)較對照組均明顯降低，而SIRT1的表達(dá)則升高，且p53乙?；档?。
　　結(jié)論:體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示七氟醚聯(lián)合氧化亞氮暴露后導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)及p53去乙酰化增加。給予SIRT1激動(dòng)劑resveratrol預(yù)處理后，能提高神經(jīng)元存活能力并能一定程度對抗吸入麻醉所致神經(jīng)毒性從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

11、　　第三部分 cAMP/CREB信號通路與七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉后致學(xué)習(xí)記憶損害相關(guān)
　　目的:cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element-binding proteinCREB)與學(xué)習(xí)記憶、長時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）以及神經(jīng)保護(hù)具有高度相關(guān)性。CREB通過cyclic AMP(cAMP)或者Ca2+依賴的蛋白激酶催化絲氨酸133位點(diǎn)磷酸化為pCREB，

12、后者對長期記憶的鞏固具有重要作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)再生過程。本部分的研究探討海馬區(qū)cAMP/CREB-神經(jīng)細(xì)胞凋亡/神經(jīng)再生與吸入麻醉致認(rèn)知功能障礙的關(guān)系
　　方法:1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉后48h及第7天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后ELISA檢測海馬區(qū)cAMP的表達(dá)，Western Blot、免疫熒光檢測pCREB/CREB表達(dá)，以及神經(jīng)再生標(biāo)志物Nestin和DCX的表達(dá)。NeuN/AnnexinⅤ雙染檢測海馬區(qū)神經(jīng)凋亡

13、，尼氏染色計(jì)數(shù)海馬區(qū)功能神經(jīng)元數(shù)。
　　結(jié)果:吸入麻醉后48h及第7天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉組海馬區(qū)cAMP及pCREB的表達(dá)較對照組均降低，而CREB的表達(dá)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異。尼氏染色發(fā)現(xiàn)吸入麻醉后48h及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉組海馬CA1區(qū)尼氏染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均較相應(yīng)的對照組降低，且神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)降低。而AnnexinⅤ/NeuN雙染結(jié)果顯示兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的麻醉組AnnexinⅤ表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯多于相應(yīng)的對

14、照組，且AnnexinⅤ陽性的細(xì)胞大部分同時(shí)NeuN表達(dá)陽性，表明發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞類型多為海馬區(qū)神經(jīng)元。Western Blot檢測Bax表達(dá)結(jié)果顯示吸入麻醉后48h麻醉組Bax的表達(dá)較對照組明顯升高，空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉組Bax的表達(dá)僅稍高于對照組，提示可能存在Bax依賴的細(xì)胞凋亡途徑。麻醉組海馬齒狀回區(qū)(dentategyms，DG)神經(jīng)元祖細(xì)胞特異標(biāo)記物nestin及未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物DCX的表達(dá)較對照組均顯著降低，提示神經(jīng)元